精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性哺乳动物个体中唯一能够将遗传信息以自然交配的方式传递给子代的成体干细胞。精原干细胞通过自我更新性增殖和分化来维持整个睾丸中完整生精过程的平衡和进行。最早关于SSCs的研究始于小鼠,并且到目前为止已成功建立了小鼠SSCs分离纯化、体外长期培养、精原干细胞移植和基因修饰等一系列技术方法。这些技术的建立不仅为小鼠生精过程的研究奠定了强有力的基础,而且为其他哺乳动物生精过程的研究提供了借鉴。虽然家畜动物SSCs研究进展相对缓慢,但随着近些年对大动物精原干细胞的研究逐步深入,在其分离纯化及长期培养方面已取得了一些重要进展。本研究借鉴已报道的哺乳动物精原干细胞的研究成果,利用本实验室已建立的大鼠、绵羊、山羊和猪精原干细胞体外长期培养的方法,对本地的黑白花奶牛精原干细胞进行了分离纯化、体外长期培养、标记分子鉴定、体外诱导分化和移植等一系列研究,已经取得了一些可喜的结果。1.黑白花奶牛精原干细胞的分离和纯化本研究以6-8月龄黑白花奶牛为研究对象,通过三步酶消化方法将黑白花奶牛的睾丸组织进行消化,并得到了大约3×107细胞(n=5,±0.5×107)。获得的单细胞悬液进一步利用明胶、胶原蛋白和层粘连蛋白Laminin等基质包被的培养皿进行差异贴壁,以达到分离纯化牛精原干细胞(bovine spermatogonial stem cells, bSSCs)的目的。为确定纯化过程中每个步骤对牛精原干细胞的富集率,本实验采取对各步骤得到的细胞进行涂片,并利用免疫荧光染色技术检测了纯化细胞中的PLZF阳性细胞比率。通过对睾丸单细胞悬液(Single cell suspension, SCS),不结合胶原蛋白Ⅰ细胞(Collagen I non-binding cells, CNB)和Laminin结合细胞(Laminin binding cells, LB)进行检测,发现经过三次差异贴壁后bSSCs所占百分比率分别为24%±5%,50%±3%和83%±7%(11=5)。本实验所的得到的bSSCs在纯度上满足了体外培养的要求,为bSSCs的体外培养方法的建立奠定了基础。2.黑白花奶牛精原干细胞的体外长期培养与保存通过对啮齿类精原干细胞长期体外培养方法的总结和改进,本实验室建立了大动物精原干细胞体外长期培养的体系。利用饲养层细胞和本实验室建立的家畜精原干细胞培养液对牛精原干细胞进行长期体外培养发现,此培养体系能够维持牛精原干细胞体外传代31次以上,并保持其形态及标记分子表达不变。通过对连续3次传代的牛SSCs进行统计发现,在此培养体系中牛精原干细胞的增殖翻倍周期为5-7天左右。为确定此培养体系中的最佳GDNF浓度,本实验通过对体外培养的牛SSCs进行添加不同浓度的GDNF (20 ng/ml,30 ng/ml、40 ng/ml),并体外连续培养7天后对牛精原干细胞进行计数统计。发现随着GDNF浓度的增加,精原干细胞的数目同样增加。当GDNF浓度为30 ng/ml以上时,相对于20 ng/m1组,对精原干细胞数目具有显著的提升作用(P<0.01)。但30 ng/ml与40 ng/ml浓度GDNF处理组之间并无显著性差异(P>0.05)。通过对成本及传代等因素的综合考虑,在本实验体系中添加30 ng/ml的GDNF为最佳体外培养牛精原干细胞浓度。综上所述,本实验采用含饲养层的无血清培养体系,通过添加GDNF、bFGF和Gfrαl等生长因子,实现了bSSCs体外长期培养,并保持其标记分子表达和生物学特性不变。长期培养方法的建立为bSSCs的深入研究提供了基础。3.体外长期培养的黑白花奶牛精原干细胞的标记分子鉴定为确定牛精原干细胞的标记分子特性,本实验首先利用牛睾丸冰冻切片免疫荧光染色技术,对啮齿类精原干细胞标记分子CDH1进行验证研究。以已报道的牛精原干细胞标记分子PLZF标记牛精原干细胞,然后进行CDH1免疫荧光染色。结果显示CDH1在牛睾丸中与PLZF在靠近基底膜的单个型、成对型和成串型的精原细胞中重叠分布,说明CDH1也是bSSCs的一个标记分子。进一步对长期培养的牛精原干细胞的基因转录进行RT-PCR检测,发现牛精原干细胞转录表达标记基因Thyl和CDHl。为了鉴定体外长期培养牛精原干细胞特性,本实验应用已报道的哺乳动物精原干细胞标记分子进行细胞免疫荧光双标染色分析,发现在体外长期培养的牛精原干细胞中PGP9.5,Gfral, Oct4, Thyl及CDH1等的分布与PLZF完全重合。这些结果说明上述基因在bSSCs中保守表达,并且证实了本研究中长期培养的bSSCs维持精原干细胞标记分子的表达特性。这些结果也为bSSCs的进一步研究提供了质量检测标准。4.黑白花奶牛精原干细胞的功能鉴定为验证本实验中体外长期培养的bSSCs是否保持分化形成下级生精细胞的能力,本实验进一步采用体外诱导分化和受体犏牛睾丸移植技术对bSSCs的分化能力进行了验证。通过借鉴Dym等体外诱导bSSCs的报道及本实验室已建立的绵羊SSCs体外诱导的方法,利用含血清的培养液中添加SCF因子对体外培养的bSSCs进行诱导,十天后利用免疫荧光染色方法在分化体系中检测到SCP3阳性精母细胞的存在,说明bSSCs在体外培养条件下具有分化的生理活性。进一步通过bSSCs体内移植实验,利用天然不育的公犏牛作为受体,将体外培养至15代并冷冻保存的bSSCs移植到犏牛的睾丸内。移植一年后,通过组织切片、Real-time PCR分析发现,受体犏牛睾丸内高表达SSCs、精母细胞和精子细胞的标记基因PGP9.5, SCP3和Tnp2,说明黑白花牛的bSSCs够在犏牛睾丸中长期存活并分化为下级生精细胞。上述结果说明bSSCs经过长期体外培养仍然维持其生物学功能和特性,同时首次证明了天然不育的犏牛可以作为SSCs移植实验的天然受体。