论文部分内容阅读
目的拟探讨亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1）与脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体p75NTR的胞吞和逆向囊泡运输关系,深入阐述亨廷顿舞蹈病的分子生物学机制。方法1、首先构建荧光融合蛋白质粒,利用基因转染、细胞免疫荧光染色等技术,在激光共聚焦显微镜下观察HAP1与BDNF、p75NTR在细胞中的表达和共定位现象:1)构建荧光融合蛋白质粒HAPlA-CFP和BDNF-DsRed、pro-BDNF-DsRed、pre-BDNF-DsRed;制备含BDNF-DsRed、pro-BDNF-DsRed和pre-BDNF-DsRed荧光融合蛋白的培养液,以及生物素标记BDNF、pro-BDNF、pre-BDNF蛋白。2)分为BDNF组、pro-BDNF组和pre-BDNF组三部分。利用荧光融合蛋白质粒HAP1A-CFP和（或）BDNF-DsRed转染PC12细胞,分别在含不同成分的培养液孵育后,应用激光共聚焦显微镜研究HAP1与BDNF在细胞中的表达和定位。3)荧光融合蛋白质粒HAP1A-CFP和p75NTR-YFP转染PC12细胞,分别在含有或无BDNF-DsRed的培养液孵育后,应用激光共聚焦显微镜研究HAP1与p75NTR在细胞中的表达和定位。4)采用免疫荧光染色的方法,将PC12细胞分二组,在含有或无生物素标记的BDNF培养基中孵育后进行免疫荧光标记（双标或三标）,在激光共聚焦显微镜下观察HAP1、p75NTR和BDNF的表达与定位。2、通过转基因鼠皮层神经元培养、基因转染和蛋白免疫印迹（Western-Blot）技术对HAP1与BNDF的胞吞和逆向囊泡运输的相关性进行更加深入的探讨和寻求相关性证据:1)根据PCR扩增基因产物鉴定鼠尾DNA结果,将离体培养的新生鼠皮层神经元为三组:正常型(HAP1+/+)、HAP1基因敲除型(HAP1-/-)和HAP1杂合型(HAP1+/-)。细胞在含有生物素标记的BDNF培养基中孵育,采用免疫荧光标记（双标或三标）技术,利用激光共聚焦显微镜观察和对照三种神经元的BDNF胞吞情况。同样的方法应用于pro-BDNF和pre-BDNF。2)荧光融合蛋白质粒HAP1A—CFP转染入HAP1-/-神经元,在同样含有lnM生物素标记BDNF蛋白（BDNF组）的Neurobasal培养基中孵育后,在激光共聚焦显微镜下监测HAP1-/-神经元的胞吞情况。同样的方法应用于pro-BDNF组和pre-BDNF组。3)培养在25cm2培养瓶中的新生鼠皮层神经元分为二组,正常组和HAP1基因敲除组。细胞在含有生物素标记的BDNF培养基中孵育,提取细胞总蛋白,采用Western-Blot技术,对照不同基因型的神经元胞吞BDNF的情况。3、通过生物素标记胞膜受体蛋白、受体漂白荧光能量转移和免疫共沉淀技术进一步探讨在BDNF的胞吞过程中,HAP1和BDNF的受体p75NTR之间的相互关系:1)离体培养新生鼠皮层神经元,按照基因分型分为二组HAP1+/+组和HAP1-/-组,采用sulfo-NHS-S-S-biotin（可逆性的不可透膜的生物素交联剂）标记活细胞膜表面蛋白,二组细胞分别在含有或无BDNF的培养基中孵育,然后利用免疫沉淀（Precipitaion）和Western-Blot技术对胞吞的p75NTR受体进行检测,探讨在BDNF胞吞过程中,HAP1是否对p75NTR的信号传递也起着重要调控作用。2)以CFP和YFP作为FRET荧光对,将载有这二种荧光蛋白探针的重组质粒—HAP1A-CFP和p75NTR-YFP共转染PC12细胞,分别在含有或无BDNF的培养基中孵育后,应用激光共聚焦显微镜和受体漂白FRET技术研究HAP1A-CFP和p75NTR-YFP的胞内能量传递和相互作用。3)将重组质粒HAP1A-CFP和p75NTR-YFP共转染HEK293细胞,将细胞在含有或无BDNF的培养基中孵育1hr,提取细胞总蛋白,采用免疫共沉淀和Western-Blot技术,并进行蛋白浓度的内参校正,检测HAP1蛋白与p75NTR是否存在生理性的相互作用。结果1、HAP1蛋白与经胞吞途径进入细胞的BDNF有高度的共定位现象,但是,与细胞内表达的BDNF几乎没有共定位,BDNF抗体或者p75NTR抗体可以完全阻断后者的共定位。2、HAP1蛋白与细胞内表达的和经胞吞途径进入细胞的pro-BDNF均有高度共定位现象;BDNF抗体可以完全阻断后者的共定位,p75NTR抗体或者sortilin抗体可以部分阻断共定位。3、HAP1蛋白与细胞内表达的和经胞吞途径进入细胞的pre-BDNF蛋白均有高度共定位现象;pre-BDNF抗体或者sortilin抗体可以完全阻断后者的共定位。4、PC12细胞转染荧光融合蛋白质粒HAP1A-CFP和p75NTR-YFP后,激光共聚焦显微镜显示BDNF、p75NTR和HAP1三种蛋白分别存在共定位,并且,BDNF可增强胞浆内HAP1蛋白与p75NTR的共定位,与对照组相比P＜0.05。5、采用细胞免疫荧光染色技术,激光共聚焦显微镜显示分化的PC12细胞中的内源性HAP1、p75NTR蛋白仅存在部分共定位,BDNF可增强胞浆内HAP1与p75NTR的共定位,与对照组相比P＜0.01。6、离体培养新生鼠皮层神经元,在含生物素标记的BDNF的培养基孵育后,经细胞免疫荧光染色技术,激光共聚焦显微镜显示HAP1+/+和HAP1+/-神经元的胞膜、树突和胞体中都有BDNF的荧光,但是HAP1-/-神经元中没有,提示BDNF的胞吞和逆向囊泡运输需要HAP1的参与,p＜0.01。7、和HAP1+/+神经元相比,HAP1+/-神经元内摄的BDNF荧光强度减弱,p＜0.05,提示皮层神经元对BDNF的胞吞可能受HAP1基因表达水平的影响。8、HAP1-/-神经元成功转染质粒HAP1A-CFP后,可以恢复对BDNF的胞吞,进一步证实HAP1是BDNF胞吞的关键蛋白。9、Western-Blot实验证明,HAP1+/+神经元中可以检测到胞吞的BDNF,分子量14kD左右;但是HAP1-/-神经元中没有。10、离体培养新生鼠皮层神经元,采用sulfo-NHS-S-S-biotin标记活细胞膜表面蛋白,然后利用免疫沉淀和Western-Blot技术对胞吞的受体进行检测。结果显示HAP1-/-神经元中检测不到胞吞的p75NTR,提示在皮层神经元胞吞BNDF的过程中,HAP1蛋白对p75NTR的信号传递起着重要的调控作用。11、利用受体漂白荧光共振能量转移（FRET）技术研究HAP1A-CFP和p75NTR-YFP之间的能量传递,结果显示,BDNF可以使HAP1A-CFP和p75NTR-YFP之间出现能量传递,即HAP1与p75NTR蛋白之间的距离在1-10nm范围,表明在活细胞生理条件下,二种蛋白之间很可能存在相互作用,与对照组相比p＜0.05。12、采用免疫共沉淀技术检测生理条件下HAP1与p75NTR之间是否相互结合。结果显示,p75NTR抗体和蛋白质A Sepharose可以从细胞蛋白质提取液中拉下HAP1,证实HAP1蛋白可以与p75NTR存在生理性的结合和相互作用。结论本研究在国际上首次发现HAP1蛋白是BDNF及其受体p75NTR的胞吞和逆向囊泡运输的关键蛋白,并且可以与p75NTR存在生理性的结合,从而介导BDNF的胞吞和逆向囊泡运输。