在当今世界,血管疾病是发病率最高的疾病之一,已日益成为威胁人类生命的主要疾患之一,临床主要治疗手段是血管移植术。用于移植的血管,除小部分应用自体血管外,大部分为各种人工血管代用品如Dacron和ePTFE等。人工血管在大口径血管移植中效果可靠,但对于小直径移植物(内径＜5-6mm)的血流灌输却是致命的。更值得注意的是,人工血管没有生长及自我修复能力。理想的血管替代物应具有良好的机械张力,有完整的内皮细胞层,具有血管生物活性,并能分泌相应的生物活性物质。　　 寻求理想的血管移植物是临床亟待解决的课题,近10多年来迅速发展的组织工程学,为这一难题的解决带来了希望。随着90年代纳米技术的出现和发展,组织工程进一步得到发展,人们开始利用纳米技术构建仿生组织工程。本研究利用静电纺丝技术制备左旋聚乳酸(PLLA)的纳米纤维支架,并利用低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂层处理,综合了内皮祖细胞及纳米PLLA支架膜的优点,将兔内皮祖细胞体外增殖培养后,作为种子细胞种植到改性后的纳米PLLA支架上,体外构建组织工程血管,再移植到兔体内,尝试一种全新的组织工程血管。全文分为六个部分:　　 第一部分、纳米级PLLA有序膜的制备和表面改性及其性能研究　　 目的:制备PLLA纳米无序纤维支架膜、有序、超级有序纤维支架膜及纳米级PLLA支架血管,为今后血管组织工程支架材料的优化提供一种新途径以及为下一步进行动物在体实验提供实验材料。　　 方法:将PLLA的混合溶液利用静电纺丝技术制备成纳米无序、有序、超级有序纤维及纳米级PLLA支架血管,通过SEM及统计学分析方法对纤维形貌进行表征。并实验分生理血管组、湿纤维支架血管、干纤维支架血管,利用CSS-2202电子万能测试仪进行应变率、拉伸弹性回复率及最大断裂强度等机械性能的测定。　　 结果:PLLA纤维直径分布均匀,其直径范围主要分布在300nm～400nm之间,孔隙率＞90％,且孔隙在三维方向上相互贯通。有序纤维及超级有序纤维具有良好的空间定向效果。记录的应力变曲线可发现,3组标本均有一定的粘弹性特征。生理血管组应变率最大,干燥PLLA支架血管应变率最小,两组比较t检验差别有显著性意义(P＜0.05)。干燥和湿性PLLA支架血管两组应变率比较t检验差别无显著性意义(P＞0.05)。正常生理血管组弹性回复率最大,干燥PLLA支架血管弹性回复率最小,两组比较t检验差别有显著性意义(P＜0.05)。干燥和湿性PLLA支架血管两组弹性回复率比较t检验差别无显著性意义(P＞0.05)。正常生理血管组最大断裂强度最大,干燥支架血管最大断裂强度最小,湿性PLLA支架血管组与正常生理血管组接近,两组比较t检验差别无显著性意义(P＞0.05)。生理血管组及湿性支架组最大断裂强度均高于干燥支架组,两两比较t检验均有显著性意义(P＜0.05)。　　 结论:本课题构建的组织工程血管应变率、最大断裂强度和应力松弛特性均接近正常生理血管组,静电纺丝技术制备的纳米化PLLA组织工程血管的生物力学特性完全符合实验使用。　　 第二部分、兔外周血晚期EPCs的分离、培养、鉴定及标记　　 目的:建立兔晚期内皮祖细胞(EPCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定、标记的方法,为EPCs进一步作为种子细胞参与体外构建组织工程血管奠定基础。　　 方法:麻醉后经兔心内猜血20 ml/只,肝素钠抗凝,PBS等体积稀释,加入预先加有比重1.096兔淋巴细胞分离液离心管上层,分离液和稀释血体积比约为3:7,常温下,2000r·min-1离心30 min,吸取中间白膜层细胞,PBS洗2次、离心2次(1000r·min-1×5 min),弃上清,留细胞沉淀,重悬于EBM-2MV(含15％的胎牛血清)全培养液中,以2×106密度接种于预先抱被好纤连蛋白(5μg·cm2)的25cm2培养瓶中,置培养箱中培养,3～4 d后换半液,7天后每3～4d换全液1次,通过换液逐步淘汰不贴壁的细胞。细胞生长达到80％～90％融合时按照1:2或1:3传代培养。每天倒置相差显微镜观察细胞生长状况。晚期EPCs的Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双荧光染色鉴定:经体外诱导分化培养16d后的EPCs贴壁细胞与10 mg·L-1的Dil-ac-LDL置培养箱孵育4 h,PBS洗3次,用2％多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗,将10 mg·L-1的FITC-UEA-I加于上述标本中37℃孵育1 h,在倒置荧光显微镜下观察。EPCs的免疫组织化学检测:贴壁细胞经体外诱导分化培养16d后,按试剂盒方法检测其是否fik-1、vWF和CD34等具有内皮细胞的特异性标志。用1m1DMSO溶解CM-Dil后,配制成2μg·ml-1 CM-DiI PBS溶液,细胞在贴壁状态下37℃孵育5分钟,4℃15分钟,PBS洗2次,荧光显微镜观察标记细胞。　　 结果:新分离的单个核细胞圆形透亮,接种数小时后开始贴壁,4d后胞体增大,第9～12天迅速长成集落,细胞呈铺路石样排列。细胞培养1个月可传代5～7次(传代比例为1:3),细胞数量可达107～108个,细胞状态始终保持良好。在倒置荧光显微镜下观察:摄取ac-LDL,呈红色,并能与LJEA-I结合呈绿色的双染色阳性细胞为正在分化的晚期EPCs;EPCs具有内皮细胞的特异性标志:fik-1、vWF和CD34。CM-DiI标记细胞阳性率100％。　　 结论:密度梯度离心结合贴壁分离培养法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增兔外周血晚期EPCs,且操作简便具有较好的可重复性,为后续实验研究提供了可靠的细胞来源。CM-DiI标记细胞阳性率100％,可以用来作为标记细胞的一种有效手段。　　 第三部分、纳米化多孔PLLA膜对晚期内皮祖细胞行为的影响　　 目的:通过观察晚期内皮祖细胞(EPCs)在纳米化多孔PLLA支架膜表面黏附、增殖的情况,为优化组织工程材料提供一种新途径。　　 方法:通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂覆,与晚期EPCs复合培养,实验分A组单纯细胞,即对照组;B组为无序膜;C组为普通膜;D组为有序膜;E组为超级有序膜。通过细胞生长曲线检测细胞增殖能力和生长规律,以及材料与细胞的生物相容性。沉淀法检测A组(control)为无序膜;B组为普通膜;C组为有序膜;D组为超级有序膜对细胞粘附率和增殖率的影响。光镜、荧光显微镜及扫描电镜观察支架材料对种子细胞黏附、增殖、形态特征等方面的影响。　　 结果:各组吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步提高;从第5 d起,普通膜、有序膜和超级有序膜组A值与无序膜、单纯细胞组差异有统计学意义(P＜0.05):单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞黏附12 h基本完成;复合培养12 h后有序膜组、超级有序膜组黏附率、增殖率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P＜0.01);有序膜组、超级有序膜组之间24 h后增殖率差异有统计学意义(P＜0.05)。细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜及普通膜细胞生长较散在、杂乱;有良好空间定向效果的有序纤维及超级有序纤维支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,分泌胞外基质,以超级有序膜更有利于保持其结构。　　 结论:纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的血管组织工程支架材料;晚期内皮祖细胞是理想的血管组织工程种子细胞来源。　　 第四部分、纳米级左旋聚乳酸支架膜的体内生物相容性实验　　 目的:利用血管支架材料体内种植实验,检测其细胞相容性和组织相容性。　　 方法:新西兰大白兔麻醉后,在背胸腰段脊柱两侧各取2个腔隙。将消毒的纳米PLLA纤维膜材料分别植入皮下腔隙中,每侧植入2块材料,术后观察兔全身及材料种植局部反应,并分别于术后1,2,3,4周各取2块材料,4％多聚甲醛固定24h后,脱水,石蜡包埋,每隔2-3mm进行切片,厚度4μm,行HE染色观察材料周围组织内的淋巴细胞与粒细胞的浸润情况。　　 结果:兔背部皮下埋植纳米PLLA纤维膜材料手术后精神、食欲均良好,切口均愈合良好。1周组HE染色镜下见以中性粒细胞浸润为主,3周后炎细胞数下降,与其下肌肉组织分界不清,包膜和材料中有中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞为主的炎性细胞浸润并伴增生的成纤维细胞。4周组材料进一步吸收变薄,呈稀疏的线条状,浸润炎性细胞数量明显减少。各组均未见组织坏死。　　 结论:研究表明PLLA纤维膜材料支架具有良好的生物兼容性,可以在组织工程研究中作为血管细胞培养的支架材料。　　 第五部分、晚期EPCs复合纳米化PLLA纤维支架体外构建组织工程血管的实验研究　　 目的:以晚期EPCs为种子细胞、以纳米PLLA纤维为支架体外构建血管组织工程材料。　　 方法:将低温等离子体技术改性及制得的Ⅰ型胶原表面涂覆制备好的生物化血管支架,用全培养液孵育,将CM-DiI标记过的种子细胞悬液调至浓度为1×105个/ml。将消毒准备好血管支架的一端用1号丝线结扎,从支架的另一端将制备好的种子细胞悬液加压灌入血管支架腔内,反复操作4-5次,用1号手术线结扎支架的另一端口,并旋转培养,HE染色观察纳米级PLLA支架血管种植晚期EPCs细胞前后的形态学变化。电镜观察及荧光显微镜观察EPCs在纳米级PLLA支架血管上的黏附及生长情况。　　 结果:HE染色显示EPCs在纳米级PLLA支架血管上的大量黏附和生长,12小时的细胞数量明显高于4小时。SEM及FM显示EPCs在纳米级PLLA支架血管上大量黏附和生长,并见大量基质和纤维丝形成。　　 结论:作为种子细胞的兔EPCs在纳米PLLA支架血管上具有较强的铺展和生长能力,所构建的组织工程血管为下一步动物血管移植实验和研制理想的临床血管代用品奠定了良好的基础。　　 第六部分、晚期EPCs复合纳米化PLLA组织工程血管兔腹主动脉置换的实验研究　　 目的:建立腹主动脉移植的动物模型,通过检测血管移植后的组织形态学变化、内皮祖细胞覆盖情况,尝试一种全新的血管代用品。　　 方法:体外将CM-DiI标记的EPCs与纳米PLLA纤维为支架体外构建组织工程血管。以新西兰大白兔为研究对象,按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉,剪下一段腹主动脉长约约2cm,再将供体血管以8/0国产聚丙烯线间置吻合到腹主动脉上。实验分A组:未种植晚期EPCs的纳米PLLA血管(n=12)(对照组);B组:种植晚期EPCs的纳米PLLA血管(n=12)。各实验动物于术后3,28,56d(n=4),观察移植段腹主动脉通畅率的情况,取出移植段动脉标本,进行大体观察。福尔马林固定,HE染色,光镜观察血管内膜、弹力纤维、胶原纤维等情况;戊二醛固定,SEM下观察纳米化组织工程血管是否内膜化。　　 结果:实验组8w内基本通畅:在移植术后3d,吻合口处动脉管壁薄;移植术后28d,血管壁稍僵硬;移植术后60d可见血管内壁光滑,管壁增厚,钙化。对照组血流不通畅者皆为血栓形成,管腔内充满鲜红色血栓及机化组织,内膜不光滑,可见大量粘附蛋白和血细胞附着。病理组织学观察:术后3d:对照组血管内膜壁血栓形成,而内膜化实验组内壁无明显附壁血栓;术后28d:对照组血管内壁结构较紊乱,内膜不光整。而内膜化实验组血管内表面血管内皮化基本完成。术后56d:对照组血管内膜仍未见内皮化,内膜相对不完整;内膜化实验组内皮祖细胞形成连续单层,合并大量基质形成,完全内膜化纳米化组织工程血管。　　 结论:本研究构建的纳米化组织工程血管,术后通畅率高,有较好的手术可操作性,为血管替代物的基础研究和临床应用提供了有价值的实验资料,但尚需要进一步的研究去证实和完善。