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牛凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶。它特异性切断牛乳中K-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键,引起牛乳凝结反应。凝乳酶在奶酪的生产中应用广泛,它的主要作用是使牛乳凝结并改善其口味。根据凝乳酶的来源不同可将凝乳酶分为四类：动物性凝乳酶,植物性凝乳酶,微生物凝乳酶以及基因工程凝乳酶。基因工程凝乳酶与其他来源凝乳酶相比,生产成本低,来源稳定。本研究首先利用PCR扩增凝乳酶原基因片段,用EcoR Ⅰ与Not I分别酶切该基因片段并与相同酶切后的pPIC9K连接,将牛凝乳酶原基因克隆到pPIC9K酵母表达载体中,经过酶切和测序方法证明pPIC9K-prochy重组子成功构建。用电脉冲法将经过Sal I线性化的重组质粒转化到毕赤酵母GS115及KM71宿主菌中。转化子在28℃,MD营养缺陷型培养基中培养2-3天后进行筛选重组菌株,最后采用摇瓶诱导的方法收集上清液,将上清液酸化至pH2.0静置两小时调至pH6.0后采用Arima K酶活测定的方法筛选出酶活相对较高的重组菌株。本实验从160株GS115-pPIC9K-prochy和160株KM71-pPIC9K-prochy重组菌株中分别筛选出一株酶活相对最高为25.0SU/mL和11.5SU/mL的重组菌株,分别将这两株重组菌株命名为：GS115-pPIC9K-prochy-32和KM71-pPIC9K-prochy-21。这两株重组菌株均分泌表达牛凝乳酶原蛋白,经SDS-PAGE实验后分析得到牛凝乳酶原条带的分子量约为44KDa,比预期的凝乳酶原略大。通过Arima K方法酸化处理后的凝乳酶原进行酶活测试并比较两种不同的毕赤酵母表达的牛凝乳酶的酶学性质,发现由GS115-pPIC9K-prochy-32表达的凝乳酶的酶活比KM71-pPIC9K-prochy-21表达的牛凝乳酶的酶活高出一倍,而且前者的稳定性要高于后者,50℃处理50min后,前者仍可保留66.7%的酶活,而后者酶活为0。两者有相同的最适温度50℃,最适pH5.7,60℃热处理20min活性全部丧失。将GS115-pPIC9K-prochy-32和KM71-pPIC9K-prochy-21两株重组菌株优化诱导培养条件,甲醇诱导228h后去上清粗酶液,在最适温度50℃及pH5.7下测得GS115-pPIC9K-prochy-32上清液的粗酶活为317SU/mL, KM71-pPIC9K-prochy-21上清液的粗酶活为180SU/mL。