L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase)是黄素蛋白酶类的一种,能够催化L-谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸、氨、过氧化氢。具有较高酶活性以及和热稳定性的谷氨酸氧化酶在工业生物应用领域将会有很大的应用空间,例如用于工厂生产、生物传感器、临床生化检测等。在本研究中,应用定向进化技术通过易错PCR构建了突变文库,建立了高通量筛选方法。通过筛选得到了谷氨酸氧化酶的4个突变体:F94L、S280T、I282M、H533R,其酶活性较野生型而言分别提高了 18%,、2.5%、18%、30%。通过对这些突变体分别进行随机饱和突变,得到I282L、H533L两个突变体,其酶活性又分别提高了 12%、30%,相比野生型提高了 30%、60%。之后,用定点突变技术将所有突变位点进行组合突变得到多位点突变体,其最高酶活的突变体为S280TH533L,其酶活性相对野生型提高了 90.7%。对谷氨酸氧化酶突变体的热稳定性测定结果发现,突变体S280T、S280TH533L在50℃处理半小时剩余酶活分别为34.8%、34.6%、8.2%,而野生型则没有活性。同时,通过Td值测定也发现,突变体S280T、H533L、S280TH533L分别比野生型高2.1℃、0.8℃、1.9℃。此外,对突变体动力学常数测定发现其Km值明显减小,而Kcat值升高,说明突变体的底物亲和力增强,且催化效率升高。通过同源建模结果分析发现,突变体突变位点位于离子通道或者活性中心附近,导致了催化活性的提高;而氢键的变化,或许导致了稳定性的提高。全细胞转化验证实验结果表明,在相同时间内,突变体能够将更多的底物催化,其摩尔转化率提高20%左右。因此,本文通过定向进化技术,提高了谷氨酸氧化酶的酶活性和热稳定性。