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目前已报道的玉米细菌性病害有13种,多表现为细菌性叶斑症状。本研究分离了国内不同玉米产区玉米细菌性叶斑病的疑似致病菌,通过致病性测定,确定了一株玉米细菌性叶斑病致病菌株。经细菌的常规鉴定与分子鉴定明确了致病菌株为PantoeaananatisSerrano,并根据该菌株的ITS序列设计了一对特异性引物对其进行快速检测。主要研究结果如下:
1.分离纯化了来自国内不同地区的57份玉米病叶标本,共筛选到35株细菌。采用多种方法对它们的致病性进行了测定:菌悬液注射接种烟草结果表明,35株菌株中有20株具有毒性;苗期喷雾接种试验表明,从津、京、冀地区天塔8号品种上分离到的菌株TJ-1-1、BJ-3-1、HB-1-1可引起相似的细菌性叶斑病症状,从回接发病的病株上分别分离到了菌株T8-TJ、T8-BJ、T8-HB;细菌悬浮液浸种试验中TJ-1-1、BJ-3-1、HB-1-1也能够引起玉米细菌性叶斑病症状的产生。试验结果表明,三株细菌菌株对玉米均表现出较强的致病性。同时,根据致病性测定结果从玉米品种天塔8号种子中分离到一株优势细菌菌株T8-1。
2.通过菌落形态观察,鞭毛电镜观察,革兰氏染色试验等一系列常规细菌生理生化测试证明TJ-1-1、BJ-3-1、HB-1-1、T8-TJ、T8-BJ、T8-HB、T8-1为同一种细菌-Pantoeaananatis(凤梨泛菌)。
3.选用16SrDNA通用引物16sF(5-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3’)/16sR(TCCCTACGGTTACCTTGTTA-3’)与ITS通用引物L1(5-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’)/L2(5-GTGCCAAGGCATCCACC-3’),对从天塔8号罹病玉米种子中分离到的细菌菌株T8-1进行扩增,得到大小约为1500bp(16SrDNA)与500bp(ITS)的DNA片段。对T8-1的16SrDNA序列克隆测序后进行BLAST搜索,结果表明T8-1与凤梨泛菌Pantoeaananatis(AF364847)的相似程度最高达98%,可确定为同属同种细菌。分子鉴定结果同病原细菌常规鉴定结果相吻合。
4.本试验扩增并克隆了致病菌株Pantoeaananas的ITS序列(目前尚未有该菌ITS序列的相关报道)。通过对其ITS序列分析,并与其余供试菌株的ITS序列比对,获得了该菌株的特异性引物片段P1作为上游引物,同时设计了一段位于23SrRNA基因保守区的序列P2作为下游引物。GeneBank的BLAST搜索及供试菌株的扩增结果表明:引物对P1/P2对所本试验所分离到的Pantoeaananatis菌株具有很高的特异性,可用于进行该菌的快速检测。