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大蒜(Allium sativum L.)是重要的药食兼用蔬菜,在世界各地广泛栽培和食用,我国是大蒜主要生产、消费和出口国。但大蒜主要以鳞茎进行无性繁殖,不仅繁殖系数低,生产成本高,而且极易积累病毒,造成种性退化,产量降低,品质下降。组织培养技术是大蒜脱毒快繁和品种提纯复壮的有效手段,但在这一过程中存在严重的玻璃化现象,限制组培技术在脱毒快繁中的应用。玻璃化试管苗形态异常,代谢紊乱,分化能力低下,增殖、成芽和生根成苗困难,移栽后难以成活,或成苗弱,生产潜力低,造成严重经济损失。国内外对植物试管苗玻璃化发生原因进行了广泛研究,其中植物内源激素的作用也引起了人们的关注。脱落酸作为5大激素之一,不仅在植物适应外界环境中发挥重要作用,而且也调节植物生长发育的各个阶段。虽然脱落酸作为外源调节物质已应用于植物组织培养,但关于脱落酸影响玻璃化发生的研究还少有报道。课题组前期研究发现,高浓度的H202会显著提高试管苗玻璃化率。因此,本研究从脱落酸和H202作用角度,对试管苗玻璃化的发生机理和调控技术进行探讨,研究对试管苗玻璃化的防控具有重要的理论意义和实用价值。本试验以大蒜品种’二水早’为材料,测定大蒜试管苗玻璃化过程中玉米素核苷(ZR)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)等内源激素含量的变化,分析其与玻璃化的关系;进一步分析外源ABA和H202对大蒜试管苗玻璃化和抗氧化系统及相关基因表达的影响。主要研究结果如下:1.测定大蒜正常试管苗和玻璃化试管苗内源激素的变化。研究发现,对于不同玻璃化程度(轻度、中度和重度)的试管苗,在继代培养第16 d,玻璃化试管苗中ABA含量均显著低于正常试管苗;中度和重度玻璃化试管苗ZR显著高于正常试管苗,且随玻璃化程度加重,ZR含量越高;而IAA和GA3与正常试管苗相比含量变化不一致。在继代培养过程中(0-16 d),玻璃化试管苗中ABA含量在培养后期(8-16 d)明显低于正常试管苗;而玻璃化试管苗的ZR含量均高于正常试管苗;玻璃化试管苗的IAA/ZR均高于正常试管苗,而ZR/ABA均低于正常试管苗;推测ZR含量升高和ABA含量降低是导致试管苗玻璃化的重要因素。2.研究了外源ABA对大蒜试管苗玻璃化的影响及最佳处理浓度。研究表明,在培养基中添加适宜浓度外源ABA,可有效抑制大蒜试管苗玻璃化,以0.1和0.5 mg.L-1的ABA抑制效果最好,玻璃化率最低。其中,0.5 mg·L-1 ABA处理能显著提高试管苗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性。3.研究了外源H202、ABA及H202+ABA处理对大蒜试管苗玻璃化的影响。研究表明,与对照相比,外源ABA单独处理可显著降低试管苗玻璃化率,H2O2单独处理显著增加了大蒜试管苗玻璃化率,ABA可显著降低由H202引起的试管苗玻璃化率的增加。ABA处理能显著降低试管苗O2·-产生速率、H202含量、丙二醛(MDA)含量和质膜透性,这可能是试管苗玻璃化率显著降低的原因。与对照相比,外源ABA单独处理可显著提高试管苗SOD、CAT、POD、APX和GR活性,提高AsA和GSH含量;与单独H202处理相比,H202+ABA处理8-16 d,能显著提高试管苗SOD、CAT、POD、APX活性和AsA、GSH含量。综上所述,外源ABA可以提高试管苗抗氧化能力,减少活性氧的积累,从而抑制玻璃化发生。4.研究了外源H2O2、ABA及H2O2+ABA处理后试管苗中抗氧化相关基因的表达变化。研究表明,经ABA处理,大蒜试管苗中POD和GR在处理后0.5 d其相对表达量达到最高值,SOD和APX基因在处理后8 d时,其相对表达水平达到最高值,RBOH表达量在处理后0.5 d达到最高值,而后降低,在处理1-16 d均低于对照;经H202处理,试管苗SOD相对表达量在处理后0.5 d达到最高值,CAAT和APX在处理后12 d,其相对表达量达到最大,在处理后8-12 dRBOH表达量均高于对照,并在第8 d达到最高值;在培养基中同时添加H202和ABA,C4T相对表达量在处理1 d时,其相对表达水平达到最高值,SOD和GRR基因在处理12 d时相对表达水平达到峰值,RBOH表达受到抑制,均低于对照。综上所述,外源ABA能通过抑制试管苗RBOH的表达,诱导SOD C4T、POD、APX和GRR的表达,来增强试管苗抗氧化能力,减少试管苗玻璃化率。