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目的:初步探讨褪黑素(MLT)对IL-1β介导胃腺癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)的抑制作用及其机制。方法:1.以人胃腺癌细胞MGC80-3和SGC-7901为研究对象,分别设立空白对照组、IL-1β组和IL-1β+不同浓度MLT组;2.通过Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力;3.运用实时荧光定量PCR检测EMT生物标志分子,如上皮细胞标志物(β-catenin、E-cadherin)和间质细胞标志物(Fibronectin、Vimentin、Snail)以及基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)等的mRNA表达水平;4.采用Western blot法检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平;5.经凝胶迁移实验(EMSA)检测转录因子NF-κB转录活性;6.通过转染NF-κB p65 siRNA验证NF-κB在IL-1β诱导胃腺癌细胞EMT中的作用及NF-κB在MLT抑制上述效应中的潜在作用机制;7.经尾静脉注射人胃腺癌MGC80-3细胞在裸鼠体内建立胃腺癌肺转移模型,癌细胞种植一周后,将裸鼠随机分为三组,即生理盐水对照组、IL-1β注射组和IL-1β+MLT注射组,经HE染色观察胃腺癌细胞肺组织转移情况,采用RT-qPCR检测肺组织中EMT生物标志分子的mRNA表达水平,并运用免疫组化法检测肺组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平。结果:1.体外细胞实验1.1 MLT抑制IL-1β诱导的胃腺癌细胞EMT:(1)IL-1β处理后,人胃腺癌细胞MGC80-3和SGC-7901的细胞形态发生变化,由原先的不规则三角形或四角形上皮细胞形态变成长梭状间质形态,但这些细胞形态变化可被MLT所抑制;(2)IL-1β处理后,MGC80-3和SGC-7901细胞侵袭迁移数量显著增加,经MLT处理后,侵袭迁移的细胞数量均明显减少,但无明显浓度依赖性;(3)经RT-qPCR检测,IL-1β处理可显著下调胃腺癌细胞中上皮细胞标志物β-catenin与E-cadherin的mRNA表达水平,并显著上调间质细胞标志物Fibronectin、Vimentin与Snail的mRNA表达水平,MLT可显著抑制IL-1β对上述基因转录水平的影响效应。1.2 MLT下调胃腺癌细胞MMP-2和MMP-9的表达:IL-1β可明显上调胃腺癌细胞MGC80-3和SGC-7901中MMP-2与MMP-9的mRNA与蛋白表达水平,MLT可显著抑制IL-1β的上述效应,但无明显浓度依赖性。1.3 MLT抑制IL-1β激活的NF-κB转录活性:EMSA实验结果显示IL-1β刺激可增强胃腺癌细胞MGC80-3和SGC-7901中NF-κB转录活性,这一效应可被MLT抑制。1.4敲减NF-κB表达可减弱IL-1β诱导的胃腺癌细胞EMT:转染NF-κB p65siRNA可显著抑制NF-κB的表达,抑制率达到75%以上。与转染scramble siRNA组比较,转染scramble siRNA+IL-1β处理组胃腺癌细胞MGC80-3和SGC-7901迁移和侵袭能力均增强,而转染NF-κB p65 siRNA+IL-1β处理组的胃腺癌细胞的迁移和侵袭能力则明显减弱;该结果表明NF-κB与IL-1β对胃腺癌细胞EMT的诱导作用密切相关。RT-qPCR与Western Blot结果显示,IL-1β处理后,转染scramble siRNA胃腺癌细胞的上皮细胞标志物β-catenin、E-cadherin的mRNA表达水平明显降低,间质细胞标志物Fibronectin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平以及MMP-2、MMP-9的mRNA与蛋白表达水平均明显增强。转染NF-κB p65 siRNA则显著下调胃腺癌细胞中上述间质细胞标志物基因的mRNA水平表达及MMP-2、MMP-9的mRNA与蛋白表达水平。2.体内动物实验2.1 MLT可有效抑制裸鼠胃腺癌肺转移:生理盐水对照组中的6只裸鼠胃腺癌肺转移发生率为50%,发生胃腺癌肺转移的裸鼠肺部肿瘤结节平均为5个;IL-1β注射组中的裸鼠胃腺癌肺转移发生率为100%,发生胃腺癌肺转移的裸鼠肺部肿瘤结节平均为9个;IL-1β+MLT注射组中胃腺癌肺转移发生率为33.3%,发生胃腺癌肺转移的裸鼠肺部肿瘤结节平均为2个。上述结果表明,IL-1β可促进胃腺癌肺转移,MLT可抑制肿瘤转移。2.2 MLT可抑制裸鼠肺组织中EMT相关基因与MMP-2、MMP-9表达水平:IL-1β可显著下调裸鼠肺组织中上皮细胞标志物β-catenin、E-cadherin的mRNA表达水平,上调肺组织间质细胞标志物Fibronectin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平以及MMP-2、MMP-9的mRNA与蛋白水平;MLT的使用可抑制IL-1β的上述效应。上述结果从分子标志物水平进一步表明IL-1β可促进EMT,MLT抑制EMT。结论:NF-κB与IL-1β对胃腺癌细胞EMT的诱导作用密切相关;MLT能明显抑制胃腺癌细胞EMT进程,降低细胞侵袭和转移能力,其机制可能与抑制NF-κB转录活性和MMP-2、MMP-9表达有关。