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研究背景:牙齿的发育是一个上皮与间充质相互作用的复杂的生物学过程,当牙冠发育即将完成时牙根开始发育。牙根发育到一定程度开始萌出,从牙齿萌出到牙根发育完成,一般需要3-5年。这期间如果发生龋病或外伤,因不能得到及时治疗,常引起牙髓病变甚至根尖周炎,导致牙齿发育停滞,处于该阶段的年轻恒牙髓腔宽大、根管壁薄、根尖敞开使牙齿极易折裂,致使恒牙幼年早失,严重影响咀嚼功能及生活质量。涉及前牙还会影响美观。因此,探索促使牙根继续发育的生物学治疗方法-牙髓牙本质再生,成为牙髓病学领域研究的热点。根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)来源于恒牙根尖乳头组织,可分化为成牙本质细胞,形成根部牙髓和牙本质。因SCAP为发育阶段的干细胞,与相同来源的牙髓干细胞相比,具有更强的增殖和分化潜能。在牙髓牙本质的研究中,SCAP作为种子细胞越来越受到重视。然而其增殖分化的机制还不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类内源性、非编码小分子单链RNA,与特定mRNA的3’端非编码区(3’UTR)互补结合,抑制靶基因表达发挥转录后调控作用。miRNA在成骨细胞分化和骨组织形成中发挥重要作用,通过靶向与成骨细胞分化相关的转录因子和信号通路,促进或抑制成骨细胞分化。研究显示许多miRNA参与调控人牙源性干细胞的成骨分化:miR-24-3p、miR-214、miR-146a和miR-195-5p在人牙周膜干细胞PDLSCs的成骨分化中发挥重要的调控作用。miR-32、miR-508-5p和miR-885-5p通过不同的机制参与调控牙髓干细胞DPSC的成骨/成牙本质分化。而在SCAP成骨/成牙本质向分化中miRNA起什么作用,机理如何,报道极少,机制尚未阐明。前期研究发现miR-376a-3p在SCAP成骨/成牙本质向分化中表达升高,本课题进一步研究miR-376a-3p对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响以作用,探讨miR-376a-3p调控细胞分化的分子机制,丰富SCAP成骨/成牙本质向分化机制的理论体系,为牙髓牙本质再生的研究奠定基础;而且基于靶向miRNA或其靶基因的牙髓牙本质再生有望为年轻恒牙牙髓及根尖周病的治疗提供新的思路与策略。研究方法与结果:第一部分 人恒牙根尖乳头干细胞的培养和鉴定研究方法:采用酶消化法(I型胶原酶和Dispase)分离培养根尖乳头干细胞;CCK-8法研究SCAP的增殖能力,绘制生长曲线;结晶紫染色观察分析细胞克隆形成情况;流式细胞术检测SCAP的干细胞标记物。成骨/成牙本本质诱导细胞,分别行碱性磷酸酶和茜素红染色检测细胞的矿化能力;成脂诱导培养SCAP,行油红O染色,检测其成脂能力,以鉴定其多向分化潜能。实验结果:附着于牙根末端的根尖乳头与牙髓组织之间呈疏松连接,易于剥离。原代培养的细胞显微镜下多为长梭形,呈束状或团簇状贴壁生长。通过CCK-8结果绘制得到SCAP的生长曲线,包括潜伏期、对数生长期、平台期三个生长时期,生长曲线形状为“S”型。间充质干细胞表面标记物STRO-1和SCAP特异性标记物CD24在SCAP阳性表达,经流式细胞术检测得到阳性细胞所占比例分别为36.5%和22.1%;而造血干细胞表面标记物CD34和CD45的阳性细胞所占比例为0.6%和0.047%,认为阴性。ALP染色细胞呈蓝紫色;茜素红染色可见大量矿化结节呈褐色;油红O染色可见红色脂滴形成。表明SCAP具有多向分化潜能。第二部分 miR-376-3p对根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的影响研究方法:SCAP成骨/成牙本质诱导培养后的0,3,7,14,21天通过qPCR检测miR-376-3p的表达水平,以了解其动态变化。进一步将miR-376-3p mimics/inhibitor转染SCAP,研究改变miR-376-3p内源性表达量对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响,检测细胞ALP活性、qPCR和Western blot检测成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平,并行ALP及茜素红染色。明确miR-376-3p在SCAP成骨/成牙本质向分化中的作用。实验结果:qPCR检测发现miR-376-3p的表达量自诱导第3天逐渐升高,直到21天。过表达 miR-376-3p 后 ALP 活性、DSPP、Collagen I、ALP 和 Runx2 mRNA 表达及蛋白水平均升高;ALP染色显示更深染的紫蓝色,茜素红染色显示褐色的矿化结节明显增多。提示过表达miR-376-3p能够促进SCAP的成骨/成牙本质向分化。反之,抑制miR-376-3p的表达后,ALP活性、DSPP等mRNA及蛋白水平均降低;ALP染色明显变浅,茜素红染色显示褐色的矿化结节显著减少。提示抑制miR-376-3p表达SCAP的成骨/成牙本质向分化被抑制。第三部分 miR-376a-3p在根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化中的作用机制研究研究方法:利用生物信息学进行靶基因预测发现4个miR-376a-3p的候选靶基因。将miR-376a-3p mimics 和 miR-376a-3p inhibitor 转染 SCAP,利用 qPCR 和 Western blot分别检测候选靶基因的mRNA和蛋白水平的表达,筛选出表达变化最明显的AKT3作为靶基因。然后通过qPCR和Western blot检测成骨/成牙本质向分化过程中AKT3的表达变化。构建包含miR-376a-3p结合位点的AKT3 mRNA双荧光素酶报告基因载体,与miR-376a-3p mimics共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因实验检测荧光强度,以证明miR-376a-3p与AKT3的靶关系。将siAKT3转染SCAP,检测ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平,行ALP及茜素红染色;研究干扰AKT3表达对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响。将miR-376a-3p inhibitor和siAKT3共转染SCAP,检测成骨/成牙本质相关基因的mRNA的表达,研究抑制miR-376a-3p和沉默AKT3对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响。实验结果:利用生物信息学及双荧光素酶报告基因实验确认AKT3是miR-376a-3p的直接靶基因;沉默AKT3后ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平升高,ALP染色显示深染的紫蓝色,茜素红染色显示褐色的矿化结节增加。提示沉默AKT3促进SCAP成骨/成牙本质向分化。挽救实验显示抑制miR-376a-3p 同时 AK 沉默 T3 能够逆转 miR-376a-3p inhibitor 对 SCAP 成骨/成牙本质向分化的抑制作用。结论:1.首次发现miR-376a-3p具有促进SCAP成骨/成牙本质向分化的作用;2.双荧光素酶报告基因实验证实AKT3为miR-376a-3p的直接靶基因;3.发现AKT3能够抑制SCAP的成骨/成牙本质向分化;4.miR-376a-3p通过靶向调控AKT3促进SCAP成骨/成牙本质向分化。