论文部分内容阅读
第一部分MP对A549细胞NLRP3炎症通路诱导机制及清肺通络方对MP感染A549细胞NLRP3炎症小体的干预作用研究目的探讨肺炎支原体(MP)在体外感染A549细胞后,诱导NLRP3炎症小体引起的免疫炎症反应与NLRP3炎症小体对A549细胞凋亡的调控作用,以及清肺通络方(QTF)对NLRP3炎症小体的调节及其下游相关细胞因子IL-18、IL-1β的干预作用。方法(1)将QTF采用水提法提取后,加入MP感染的A549细胞中,使用CCK-8实验检测不同浓度(0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L)和不同时间点(24h、48h、72h)的QTF,计算出药物最佳浓度。(2)制备抑制/过表达NLRP3质粒,根据CCK-8实验所测得的最佳药物浓度,将实验进行分组。(3)使用Westernblot法检测NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达;Real-time PCR法检测ASC、Caspase-1、NLRP3基因;ELISA法检测炎性细胞因子IL-18、IL-1β的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率。观察MP对NLRP3炎症小体的激活及QTF对NLRP3炎症小体的作用。结果(1)CCK-8实验结果显示,清肺通络方水提物IC50=52.856%,对应为48h A549细胞存活率,且药物浓度提高则对细胞的保护作用增强,并成浓度依赖性。(2)MP感染A549细胞后,使得A549细胞NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达量上升,下游相关炎症细胞因子IL-18、IL-1β表达水平升高明显,说明NLRP3炎症小体可以被MP激活,并且产生一系列的炎症反应,且流式细胞术检测发现MP感染A549细胞后,细胞凋亡率上升。(3)经清肺通络方干预后,NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达量下降,下游相关炎症细胞因子IL-18、IL-1β表达水平显著降低,说明清肺通络方可以抑制被激活的NLRP3炎症小体,从而使下游炎症细胞因子IL-18、IL-1β下调,且流式细胞术检测发现使用清肺通络方后,细胞凋亡率下降。结论(1)MP感染A549细胞后,可以激活处于抑制状态的NLRP3炎症小体,并且产生一系列的免疫炎症反应,增加下游炎症因子的释放,增加细胞凋亡率。(2)体外细胞实验证明,清肺通络方可以下调NLRP3炎症小体,减轻炎症反应,抑制细胞凋亡,并且清肺通络方对NLRP3炎症小体的调控作用有浓度依赖性,浓度越大,保护作用越明显。第二部分NLRP3炎症通路在MP感染BALB/C小鼠的表达及清肺通络方的干预作用目的研究清肺通络方对MPP小鼠NLRP3炎症小体组成蛋白Caspase-1、NLRP3及下游炎症细胞因子的影响,进一步从体内实验验证清肺通络方对NLRP3炎症通路的调控作用。方法(1)将100只BALB/C小鼠随机平均分为5组,每组20只:A组为正常对照组;B组为模型组;C组为清肺通络方组;D组为阿奇霉素组;E组为中西医结合组。(2)分别于实验第1-3天和第8-10天MP滴鼻造模,造模第一天开始灌胃给药。A组、B组使用生理盐水灌胃10天;C组使用清肺通络方灌胃10天;D组第1-3天和第8-10天使用阿奇霉素药液灌胃10天;E组使用阿奇霉素药液+清肺通络方联合灌胃10天。(3)实验第6天、第11天分批处死小鼠,每次每组10只。采用Westernblot法检测MPP小鼠NLRP3炎症小体各组成蛋白Caspase-1、NLRP3表达;Real-time PCR法检测Caspase-1、NLRP3基因;ELISA法检测炎性细胞因子IL-18、IL-1β表达水平;HE染色法观察MPP小鼠肺组织病理生理形态。结果(1)除正常组小鼠MP-DNA基因拷贝数显示无感染外,模型组和各治疗组都为阳性,第6天和第11天MPP小鼠肺组织NLRP3炎症小体各组成蛋白Caspase-1、NLRP3表达量均上升,下游炎症因子IL-18、IL-1β表达水平升高。两次取材结果相对比,第11天Caspase-1、NLRP3表达量,IL-18、IL-1β表达水平比第6天上升明显。(2)各治疗组与模型组比较MP-DNA基因拷贝数降低明显,第6天和第11天MPP小鼠肺组织NLRP3炎症小体各组成蛋白Caspase-1、NLRP3表达量均下降,下游炎症因子IL-18、IL-1β表达水平显著下降。两次取材时间对比,第11天Caspase-1、NLRP3表达量,IL-18、IL-1β表达水平比第6天明显下降。(3)清肺通络方组与阿奇霉素组相比,MPP小鼠肺组织NLRP3炎症小体各组成蛋白Caspase-1、NLRP3表达量及下游炎症因子IL-18、IL-1β表达水平无明显差异;中西医结合组与清肺通络方组、阿奇霉素组相比,MPP小鼠肺组织NLRP3炎症小体各组成蛋白Caspase-1、NLRP3表达量及下游炎症因子IL-18、IL-1β表达水平下降显著。(4)HE染色结果显示正常组小鼠肺组织结构完好,模型组小鼠支气管及肺泡充血明显,并有大量炎症细胞浸润,清肺通络方干预后,各治疗组均有不同程度改善,中西医结合组小鼠支气管及肺泡充血、炎症细胞浸润情况改善最明显。结论(1)从体内实验可以证明清肺通络可以通过调控NLRP3炎症小体减轻炎症反应,减轻肺组织损害。(2)从反复肺炎支原体感染来看,清肺通络方联合阿奇霉素治疗MPP具有较好优势。