1.基于数据挖掘方法探究国医大师薛伯寿教授治疗膝骨关节炎的用药经验目的:运用数据挖掘技术与人机结合的方法,总结薛伯寿教授诊治膝骨关节炎的临床经验及学术思想。方法:通过建立薛老治疗膝骨关节炎的病案数据库,利用OLAP、复杂网络技术等数据挖掘方法,并通过专家访谈、人机结合方法,分析薛老临床病案的临床特征、证候特点、常用治法、选方特点、核心处方、用药特点等,以期系统总结薛老诊治KOA的组方用药规律。结果:（1）临床特征:临床症状主要为膝关节病变,如膝关节疼痛、活动受限、肿痛、冷痛、刺痛、灼痛、肿胀、僵硬。还出现其他如腰痛、腰酸、颈肩痛、髋关节疼痛、足跟痛、踝关节疼痛等关节症状及畏寒、失眠、自汗、头晕、乏力等全身症状。舌象中舌质多见淡、暗、胖、润,舌苔多见薄白、薄白腻、薄黄腻。脉象多为沉、细、弱、弦、滑以及其组成的复合脉象。症状关联分析发现膝痛与腰痛关联性最强。（2）证候特征:肾虚寒湿证的频次最高,肾阴阳两虚证,肾虚湿阻证、肾虚血瘀证、肾虚湿热证、肾虚痰阻证等肾虚类证候及湿热内蕴证、寒湿阻络证、血瘀水停证、湿浊阻滞证、气滞血瘀证等偏实性证候频次也相对较高。证候关联分析发现寒湿阻络证与肝肾亏虚证相关性最强,其次为肾虚寒湿证与血瘀水停证、肾虚血瘀证与气滞血瘀证、肾阳虚证与肾虚寒湿证。（3）常用治法:补肾法的频次最高,其次为散寒、温肾、化湿、清热、利水、滋阴、通络、温阳、活血、化痰、温经、疏肝、健脾、化瘀等。（4）选方特点:共选用方剂96首,多为古方加减,肾着汤频次最高,其次为黄精丹、二仙汤、四逆散、玉屏风散、贞芪扶正汤、黄芪赤风汤、四妙散、四妙勇安汤、独活寄生汤等。（5）核心处方:核心处方的药物为牛膝、桑寄生、生杜仲、续断、巴戟天、女贞子、黄芪、烫骨碎补、木瓜、细辛、当归、川芎、干姜、茯苓、炒白术、天麻,常用配伍有生薏仁与黄柏、炒苍术、威灵仙合用,仙茅与炙淫羊藿、知母合用,全蝎与虎杖合用,山药与山茱萸合用,玄参与银花合用,葫芦巴与鹿角镑合用。其余每一证型均有其核心方与加减变化。（6）用药特点:共使用210味中药,常用药物有牛膝、茯苓、当归、蜜炙甘草、麸炒白术、桑寄生、防风、葛根、天麻、黄芪、细辛、威灵仙、酒女贞子、黄柏、木瓜、北柴胡、大枣、白芍、制巴戟天、生姜、烫骨碎补、干姜、续断、全蝎、生杜仲、鹿角镑等。药物类别中补虚药频次最高,其次为清热药、活血化瘀药、解表药、利水渗湿药、理气药、祛风湿药等。性味多为甘温之品,多归肾经、肝经、脾经、肺经、心经。药物配伍中桑寄生与牛膝相关度最高,茯苓与炒白术、牛膝与茯苓、茯苓与当归、桑寄生与茯苓、天麻与牛膝等相关度均较高。必要时薛老还会使用有毒中药,如全蝎、黑附子、仙茅,及有小毒的炒苦杏仁、制吴茱萸、盐蒺藜、蛇床子、川楝子。结论:薛老认为KOA的主要病机是肾虚为本兼夹寒湿、血瘀、湿热等实邪。临床辨治KOA时,以补肾为大法,兼以散寒、化湿、清热、利水、活血、化痰等法。2.补肾壮骨方对KOA豚鼠软骨与软骨下骨组织形态学及血清细胞因子的影响目的:通过观察补肾壮骨方对KOA自发模型Hartley豚鼠膝骨关节软骨及软骨下骨病理改变情况及血清细胞因子水平,验证补肾壮骨方对KOA的防治作用。方法:将50只4月龄的普通级未怀孕的雌性Hartley豚鼠随机分为5组,分别设为模型组、雷帕霉素组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组,每组10只。中药组给与补肾壮骨方汤剂按照1.4g/Kg/d的量进行灌胃,雷帕霉素组予以雷帕霉素溶液按0.5mg/Kd/d的剂量进行腹腔注射。所有动物干预4周后处死并采集血液、膝关节软骨、膝关节组织。采用ELISA法检测豚鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。对豚鼠膝关节进行组织切片并行HE染色,在光镜下观察膝关节软骨形态学并依据Mankin评分对其进行评分。运用Micro-CT,观察软骨下骨3D成像图,并对软骨下骨形态学指标进行统计分析。结果:（1）Mankin评分显示:与模型组相比,雷帕霉素组及中药各组的评分均较低,具有明显差异（P＜0.05）。中药高剂量组与雷帕霉素组评分无明显差异（P＞0.05）。（2）ELISA检测显示:中药各剂量组均能够降低血清的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平,并随中药剂量降低其水平呈上升趋势（P＜0.01,P＜0.05）。与雷帕霉素组相比,中药高剂量组IL-1 β、IL-6的浓度无明显差异（P＞0.05）,中药各剂量组TNF-α浓度更低（P＜0.01）。（3）Micro-CT检测显示:模型组豚鼠胫骨软骨下骨骨小梁数量明显减少,分布稀疏,排列紊乱,出现断裂,小梁间隙明显增大,部分区域出现结构缺失,出现骨陷窝,且皮质骨变薄。中药各组与雷帕霉素组相较于模型组,其骨小梁数量更多,分布更密集,纹理更有序。其中中药组随着中药浓度增加,骨小梁数量增多,骨小梁逐渐变得致密,中药高剂量组的软骨下骨结构最为完整。通过膝关节软骨下骨各形态学指标进行统计分析后发现:在骨体积分数（BV/TV）方面,与模型组相比,中药高剂量组、中药中剂量组、雷帕霉素组中均升高（P＜0.01）,且三组无明显差异（P＞0.05）。在骨小梁厚度（Tb.Th）方面,与模型组相比,中药高剂量组与中药中剂量组明显降低（p＜0.05）。在骨小梁数量（Tb.N）方面,与模型组相比,中药各组均明显升高（P＜0.01）,雷帕霉素组无明显差异（P＞0.05）。在骨小梁分离度（Tb.Sp）方面,与模型组相比,中药高剂量组与中药中剂量组明显降低（p＜0.05）,雷帕霉素组与中药低剂量组无明显差异（P＞0.05）。在结构模型指数（SMI）方面,与模型组相比,各组均无明显差异（P＞0.05）。在骨密度（BMD）方面,与模型组相比,仅中药高剂量组明显升高（P＜0.05）,其余各组均无明显差异（P＞0.05）。（4）电镜超微结构显示:模型组软骨细胞呈现不规则形态,细胞器结构异常。雷帕霉素组及中药高、中剂量组软骨细胞形态结构较完整,细胞呈椭圆形,细胞外层绒毛样凸起连续且完整,细胞器结构清晰完整。雷帕霉素组及中药高剂量组软骨细胞中观察到自噬小体。结论:补肾壮骨方能降低血清的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平,对软骨及软骨下骨有保护与修复作用。3.基于PI3K/AKT和AMPK信号通路补肾壮骨方疗效机制探究目的:探讨补肾壮骨方对调控PI3K/AKT和AMPK信号通路干预膝骨关节炎软骨损伤的分子机制。方法:将90只4月龄的清洁级未怀孕的雌性Hartley豚鼠随机分为5大组,模型组、雷帕霉素组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组,每大组18只,每大组又分别分为2周组、4周组、6周组,共计18小组,每小组6只。中药组给与补肾壮骨方汤剂按照1.4g/Kg/d的量进行灌胃,雷帕霉素组予以雷帕霉素溶液按0.5mg/Kd/d的剂量进行腹腔注射。所有动物分别在2周、4周、6周时处死并采集关节软骨、膝关节组织。用Wstern blot检测豚鼠膝关节软骨组织蛋白 PI3K、Atk、AMPK、mTOR、ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ 的蛋白表达。用 RT-qPCR 检测 PI3K、Atk、mTOR、AMPK、ColⅡ、ColX 的基因表达水平。结果:（1）Wstern blot结果显示:2周时,与模型组比较,中药高剂量组明显下调PI3K（P＜0.01）,明显上调ULK1（P＜0.01）;中药高、中剂量组明显下调 mTOR（P＜0.01,P＜0.05）,明显上调 AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（P＜0.01）;中药各剂量组Akt无显著差异,但呈下降趋势。4周时,与模型组相比,中药高剂量组能明显下调 PI3K、Atk、mTOR（P＜0.01）,明显上调 AMPK、ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（P＜0.01）。中药中剂量组能明显下调mTOR,明显上调AMPK、ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（P＜0.05）,中药低剂量组无明显差异,但PI3K、Atk、mTOR表达呈下调趋势,AMPK、ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达呈上调趋势。6周时,与模型组相比,中药中、高剂量组能明显下调PI3K、mTOR（P＜0.01,P＜0.05）,明显上调AMPK（P＜0.05）,中药高、中剂量组Akt呈下降趋势,ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均呈上升趋势。（2）RT-qPCR结果显示:2周时,与模型组相比,中药高剂量组PI3K基因表达水平明显下调（P＜0.01）,AMPK基因表达水平明显上调（P＜0.01）,中药高、中剂量组mTOR基因表达水平明显下调（P＜0.01）,中药各剂量组Akt基因表达水平呈下调趋势,中药高、中剂量组COLⅡ基因表达水平明显上调（P＜0.01）,COLX基因表达水平明显下调（P＜0.01）。4周时,与模型组比较,中药高、中剂量组PI3K、mTOR基因表达水平明显下调（P＜0.01）,AMPK基因表达水平明显上调（P＜0.01）,中药各剂量组Akt基因表达水平明显下调（P＜0.01）,中药高、中剂量组COLⅡ基因表达水平明显上调.（P＜0.01）,中药高、中剂量组COLX基因表达水平明显下调（P＜0.01）。6周时,与模型组比较,中药高剂量组中药高剂量组PI3K基因表达水平明显下调（P＜0.05）,中药高、中剂量组Akt、mTOR基因表达水平明显下调（P＜0.01）,AMPK基因表达水平明显上调（P＜0.01）,中药各剂量组COL Ⅱ基因表达水平明显上调（P＜0.05,P＜0.01）,中药各剂量组COLX基因表达水平明显下调（P＜0.01）。结论:补肾壮骨方能抑制PI3K/Akt通路并激活AMPK通路,从而抑制mTOR,提高自噬活性,恢复软骨细胞稳态,起到防治OA的作用。