孤独症是最常见的神经发育障碍性疾病之一。其典型的特征主要表现为社会交往障碍,语言交流障碍,兴趣狭窄和行为刻板重复。据统计,在全球范围内孤独症的患病率持续增加,给个人和社会带来严重的精神和经济负担;最近的流行病学报道称,每100人至少有一个患有孤独症。据美国疾病预防控制中心数据显示,2012年美国儿童患病率为1/68,并且男孩的患病率高于女孩,男女比例约为4.2:1。孤独症的病因复杂,尚无确切的诊断或治疗方法。为寻找疾病生物标志物,探讨疾病发生机制,本研究通过三个不同的层面:外周血单核细胞(孤独症患儿与健康对照外周血单个核细胞)、外周血(孤独症患儿与健康对照外周血)和动物模型(VPA诱导的孤独症模型鼠)展开了研究。首先通过定量蛋白质组学iTRAQ分析,开展了孤独症患者与健康对照外周血单个核细胞(PBMCs)的差异蛋白质组学研究。孤独症患儿组与健康对照组比较,结果显示有53个蛋白发生了明显变化,发现这些蛋白质与线粒体、代谢途径、内质网(ER)应激和蛋白质折叠、内吞作用、免疫以及炎症反应和细胞粘附有关。生物信息学分析结果显示:内质网应激,未折叠蛋白反应(UPR),急性期反应(APR),炎症反应和内吞作用/吞噬作用可能参与孤独症的病理生理过程。在差异表达蛋白质中有20种蛋白质属于线粒体蛋白,其中17种蛋白质在孤独症患儿中表现上调。免疫印迹实验验证结果与蛋白质组学结果吻合,结果提示孤独症患儿的PBMCs可能被“激活”,另外我们通过ELISA验证了血浆中检测到的,在文献中也有报道跟孤独症相关的四种促炎细胞因子(IFN-γ,IL-1β,IL-6和TNF-α),结果发现在血浆中均表现上调。与前期血浆定量蛋白质组学的结果对比,我们检测了在PBMCs中发现的与血浆蛋白质一致的三个蛋白质(C3,CALR和SERPINA1)的表达水平,二者同时检测能提高检测的特异性。这些蛋白质可能作为孤独症诊断的潜在生物标志物。其次,我们通过公共数据库(Gene Expression Omnibus,简称GEO数据库)收集孤独症脑组织转录组数据,采用SAM(Significance Analysis of Microarrays,基因芯片显著性分析)的方法来筛选孤独症特征基因,寻找到孤独症相关基因379个,其中364个基因的表达发生了变化,6个表达上调,358个表达下调;对这些基因表达的蛋白进行GO(Gene Ontology,简称GO)分析发现,这些蛋白主要分布于线粒体、髓鞘、细胞质、液泡膜,参与三羧酸循环、神经递质运输、突触小泡胞吐作用等生物学过程,分子功能主要包括突触后密度、ATP结合、蛋白质结合等。通过生物信息学方法对这些蛋白能否进入血蛋白进行预测,结果显示59个蛋白可能“入血”,即在脑和血液均能检测到。通过文献分析,10个蛋白已有文献报道与孤独症发生相关;我们通过EILSA实验检测发现,其中RARS、ACTL6B、PRKAA1、SLC25A12、LIMK1、BDNF等6个蛋白出现显著下调,与预测和文献报道一致;ARHGEF4、POLR3C、SLC25A27等3个蛋白表现为下调趋势,但统计学分析无显著性差异;SLITRK5则表现为上调,差异具有显著性(p-value=0.0185)。通过对丙戊酸诱导的孤独症大鼠iTRAQ实验结果发现102个肽锻数大于等于2,p-value小于0.05的差异蛋白质;对这102个差异表达蛋白进行细胞成分分析,发现这些蛋白质都是定位于髓鞘、外泌体、线粒体、膜、轴突和细胞质,特别提出的是,我们富集到了37个线粒体相关蛋白,其中有27个表达上调,2个表达下调;对差异表达蛋白进行生物学过程分析显示,生物学过程主要包括三羧酸循环、糖酵解过程、柠檬酸盐代谢过程、对药物的反应、ATP水解耦合质子运输等相关;对差异表达蛋白进行体内的分子生物学功能进行富集,发现这些蛋白质在体内主要承担着蛋白质结合、ATP结合、ATP酶活性、蛋白激酶结合等分子生物学功能。基于这些发现,我们可以得出结论,这里报道的蛋白质不仅有助于进一步了解该疾病的病理机制,而且还可以在进一步深入研究后用作早期检测的生物标志物。