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背景： 乙型肝炎病毒(HBV)变异株是病毒基因碱基序列与同型的代表株或共有序列比较有独特的变化。HBV的DNA多聚酶由于在DNA复制过程中缺乏校正功能,具有较高突变率。在慢性感染者中,HBV持续承受宿主巨大的免疫压力,更易发生变异,但大多数变异并无实际意义;若变异发生在重要功能的区段内,影响了病毒蛋白质的合成和结构,可使变异的病毒逃避免疫监控,大量复制增殖,致病性增强,导致乙肝慢性化、重症化及致癌化。既往重点对HBV基因组、P基因区、前C及C区的变异研究,而位于HBV基因前C/C区上游约200bp左右的X区(nt1374-nt1838)是目前研究的热点,其含有基本核心启动子(Base Core Promoter,BCP)、核心上游调节序列(Core Upstream Regulation Sequences,CURS)、负性调节元件(Negative Regulation Element,NRE)、增强子Ⅱ(Enhancer,EnhⅡ)和直接重复序列(Direct Repeatsequence,DR)1,2等重要的基因表达调控元件,编码154个氨基酸残基的X蛋白,具有广泛的反式激活作用,在HBV的复制和表达中起重要作用。因此,据上述推测,HBVX基因变异对HBV复制及乙肝患者病程进展起着重要影响。 目的： 研究HBVX基因变异对HBV复制情况、乙肝患者病程进展、肝功能的影响及与HBV基因型的关系,为临床治疗乙肝患者及监测病情进展提供理论基础。 方法： 根据2005年病毒性肝炎防治方案诊断标准,将168例乙肝患者分为乙型肝炎携带者为29例,慢性乙型病毒性肝炎为70例,肝炎肝硬化31例,乙肝肝癌38例。所有入选患者以无菌操作取新鲜血液4ml。标本离心后分离血清置EP管,放入-70℃低温冰箱保存。采用PCR-HRM分析技术检测血清HBVX基因变异情况;直接测序(或克隆测序)确认变异位点;利用NCBI网站上的genotypetool确定HBV基因型;ELISA检测HBV血清标志物;采用日立7600型全自动生化分析仪检测肝功能指标(ALT、AST、ALB及TBIL);放射免疫技术检测肝纤维化指标(HA、LN、IV-C及PIIIP)。 结果： 1.采用PCR-HRM分析技术能很好地区分基因不同位点突变。168例乙肝患者血清HBVX区段突变检出率前五位的位点是nt1764(72.6％)、nt1719(68.5%)、nt1762(67.8%)、nt1727(54.2%)、nt1726(37.5%)及nt1730(37.5%)。 2.HBVX基因变异与血清肝脏功能指标无显著性关系(p>0.05,t检验)。在HCC病例组里,BCP双变异联合CP聚集变异与层粘连蛋白(LN)之间差异有统计学差异(p<0.05)。 3.HBeAg阴性组BCP双变异(nt1762A→T/1764G→A)联合CP聚集变异(nt1719T→C/1726A→C/1727A→T/1730C→G)、nt1755A-C/nt1768T-A双变异的检出率均显著高于HBeAg阳性组(p<0.05)。 4.HBVDNA高水平(105copies/ml≤HBVDNA)BCP双变异联合CP聚集变异、nt1755A-C/nt1768T-A双变异的检出率均显著高于HBVDNA低水平组(103copies/ml≤HBVDNA<1×105copies/ml)(p<0.05)。 5.HBVC基因型中BCP双变异、CP聚集变异、BCP双变异联合CP聚集变异及nt1755A-C/nt1768T-A发生率均较B基因型高(p<0.05)。 6.BCP双变异联合CP聚集变异和nt1755A→C/nt1768A→G双变异检出率随着乙肝病程进展有升高的趋势,在乙肝肝癌组中检出率最高。 结论： 1.PCR-HRM分析在HBV基因突变检测中是一种较新的技术,但此技术对所检测样本要求较高,可能影响其在临床的广泛使用。 2.nt1755A→C/nt1768A→G双变异是除BCP双变异外新的双位点联合突变。 3.HBVX基因变异能导致乙肝患者血清HBeAg表达障碍,同时能提高变异株HBV复制能力,且与HBVC基因型、乙肝患者病程密切相关。 4.BCP双变异联合CP聚集变异能加重乙肝患者病情,趋向肝硬化、肝细胞癌发展。