【摘 要】
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脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域。根据脂筏在低温(4℃)不溶于去垢剂的性质,我们用去垢剂TritonX-100处理棉铃虫幼虫
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脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域。根据脂筏在低温(4℃)不溶于去垢剂的性质,我们用去垢剂TritonX-100处理棉铃虫幼虫及其它三种鳞翅目幼虫(菜青虫,斜纹夜蛾,二化螟)中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏,再用Optiprep密度梯度离心将去垢剂不溶组分分离。以神经节苷脂(GM1)作为脂筏的标志分子,采用辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素-p-亚基对其进行亲和标记,点印迹法化学发光检测神经节苷脂的表达。结果成功分离制备了四种鳞翅目昆虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡上脂筏。比较了转Bt基因棉棉铃虫抗性品系(YCR)和敏感品系(YCS)幼虫中肠液、BBMV及其上脂筏中的酶活性。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是两类主要的丝氨酸蛋白酶,测定结果显示两种酶活性是中肠液高于BBMV, BBMV高于其上脂筏；氨肽酶活性则相反：中肠液活性远远低于BBMV,而BBMV低于其上脂筏的活性,这是由于氨肽酶是GPI-锚膜蛋白,在中肠液中的含量较低,而BBMV中氨肽酶活性低于其上脂筏活性说明相对BBMV,氨肽酶在脂筏中有一定程度的富集。而比较抗感品系之间大部分酶活性均是敏感品系高于抗性品系。仅碱性磷酸酯酶中肠液,总蛋白酶中脂筏抗性高于敏感品系。比较了四种鳞翅目昆虫—棉铃虫、斜纹夜蛾、二化螟和菜青虫幼虫BBMV和其上脂筏的酶活性。其中氨肽酶的活性均存在BBMV低于其上脂筏的关系,而胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,碱性磷酸酯酶均存在BBMV高于其上脂筏的关系。其后又对实验数据进行进行如下处理：将每种昆虫BBMV和脂筏酶活性相比得到一数值发现它们的差异程度存在如下关系：二化螟大于菜青虫,菜青虫大于斜纹夜蛾(以棉铃虫敏感品系为标准),这与几种昆虫在分类上的近远源关系是一致的。研究中我们分别采用点印迹(Dot-blot),酶联免疫(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)的方法检测棉铃虫抗性和敏感品系中的钙粘蛋白。应用Dot-blot和ELISA方法检测时,分别从定性和定量的角度对钙粘蛋白在昆虫中肠的存在情况进行分析,在Dot-blot检测中,敏感品系的斑点相对于抗性品系具有较深的印迹,可与室内的敏感品系明显区分；在ELISA检测中,敏感品系的OD值高于抗性品系的OD值,且差异显著,两种检测方法结果一致。ELISA检测具有分析容量大,标准化程度高的特点；Dot-blot具有操作简便,灵敏度高的特点,该研究为田间棉铃虫的钙粘蛋白缺失突变造成的抗性检测提供了技术支持,为Bt抗性的检测提供了又一可能的技术手段。
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