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目的:非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除酒精和其他明确的损伤肝脏的因素之外,所发生的肝脏病变,是最常见的慢性肝脏疾病。肝细胞脂质从头合成（de novo lipogenesis,DNL）的增加是NAFLD发生的重要诱因。脂肪酸转运酶（fatty acid translocase,FAT/CD36）作为一种脂肪酸转运蛋白,在多种类型细胞中广泛表达,通过促进游离脂肪酸的摄取参与NAFLD的发病机制。然而,CD36与DNL的关系尚未报道。因此,本课题旨在探讨CD36对肝细胞DNL的影响及其潜在机制。方法:第一部分:建立高脂饮食诱导的小鼠NAFLD模型,检测肝脏CD36蛋白和m RNA表达情况;分析GEO数据库（GSE151158）中,NAFLD人群中CD36 m RNA表达情况;建立小鼠饥饿-进食模型和胰岛素处理模型,检测肝脏CD36和脂质合成通路的蛋白表达情况。用胰岛素处理Hep G2细胞不同时间（0 h,0.5 h,1 h,3 h,6 h,12 h）并提取细胞全蛋白,检测肝脏CD36和脂质合成通路的蛋白表达情况。第二部分:构建肝细胞特异性CD36敲除小鼠(Cd36lko)及其对照小鼠(Cd36fl/fl),给予高脂饮食喂养16 w诱导NAFLD,期间每周称量小鼠体重和饲料消耗量。葡萄糖耐量实验（glucose tolerance tests,GTTs）和胰岛素耐量实验（insulin tolerance tests,ITTs）分析小鼠机体胰岛素敏感性;血清学检测血糖、血脂和肝功的变化;酶学方法检测肝脏组织TG和TC含量;肝脏组化染色评估肝脏形态学和病理改变;RNA高通量测序寻找CD36调控肝细胞脂质代谢相关的基因;实时定量PCR（Q-PCR）或Western blotting检测脂质代谢通路变化。构建CD36过表达稳定细胞系（CD36OE）或分离培养Cd36fl/fl和Cd36lko小鼠原代肝细胞,BODIPY493/503染色和Western blotting观察CD36对肝细胞脂质积聚和脂质合成相关蛋白的影响。第三部分:分离Cd36fl/fl和Cd36lko小鼠肝脏组织的内质网和高尔基体组分;分离CD36OE和CD36NC细胞中细胞核和细胞浆蛋白;Western blotting检测SREBP1表达情况。在CD36OE细胞或Cd36lko小鼠原代肝细胞中,通过免疫荧光染色观察SREBP1在细胞核和高尔基体的定位情况以及SCAP在高尔基体的定位。通过免疫共沉淀法和邻位连接技术（proximity ligation assay,PLA）检测CD36OE细胞中CD36与INSIGs蛋白之间的相互作用情况。在Hep G2细胞中单独转染HA-full-length SREBP1（FL-SREBP1）或与Flag-CD36共转染,通过Western blotting检测SREBP1及SREBP1通路的蛋白表达情况。在Hep G2细胞中单独转染或共转染小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）以敲低CD36和/或INSIG2表达,或用SREBP/SCAP复合物抑制剂25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol,25-HC）或白桦脂醇（betulin）处理CD36OE细胞,通过Western blotting和免疫荧光染色检测SREBP1通路的变化和SREBP1核定位情况。结果:第一部分:在高脂饮食模型中,小鼠肝脏CD36蛋白和m RNA表达明显升高。在饥饿-进食模型和胰岛素处理中,与单纯饥饿状态相比,正常进食、饥饿后再进食和胰岛素处理都使小鼠肝脏CD36蛋白表达增加,并且SREBP1通路相关的蛋白表达也增加。在Hep G2细胞中,胰岛素能够诱导CD36的表达,激活SREBP1通路,并且呈现出时间依赖性。第二部分:高脂饮食喂养16 w后,与对照Cd36fl/fl小鼠相比,Cd36lko小鼠体重减轻,血清TG水平降低,胰岛素耐量曲线下面积减少,提示Cd36lko小鼠糖脂代谢改善。进一步,肝脏HE染色、油红O染色及肝脏TG、TC定量测定表明Cd36lko小鼠肝脂肪变性明显减轻。RNA高通量测序结合生物信息学分析发现,Cd36lko小鼠肝脏SREBP1、PPARγ、ACLY、ACCα和FASN等DNL相关基因表达降低。同时,Q-PCR和Western blotting分析证实,与Cd36fl/fl相比,Cd36lko小鼠肝脏脂质合成通路即SREBP1通路相关基因和蛋白水平降低,这表明CD36缺失可能降低肝脏脂质从头合成。同样在体外细胞实验中发现,CD36过表达能够促进胰岛素诱导的细胞脂质积聚增加和SREBP1通路激活,而在分离培养的Cd36lko小鼠原代肝细胞中出现相反的结果。这表明CD36促进胰岛素介导脂质从头合成,进而促进肝细胞脂质积聚。第三部分:对Cd36fl/fl和Cd36lko小鼠肝脏组织内质网和高尔基体组分进行分离发现,在ER组分中,两种基因型小鼠SREBP1的蛋白水平相近;而在高尔基体组分中,Cd36lko小鼠SREBP1表达降低。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白发现,细胞核SREBP1在CD36OE细胞中显著增加。免疫荧光染色发现,在Cd36lko小鼠原代肝细胞中,SREBP1的细胞核和高尔基体定位和SCAP的高尔基体定位都降低;而在CD36OE细胞中出现相反的结果。接下来为了直接确认CD36调节SREBP1裂解,我们将外源性HA-FL-SREBP1引入CD36OE和NC细胞,Western blotting检测发现,FL-SREBP1在CD36OE和NC细胞过表达程度一致,但成熟形式N-SREBP1在CD36OE细胞中显著增加。这表明CD36参与调节SREBP1的蛋白水解加工。在CD36OE Hep G2细胞中,通过免疫共沉淀和PLA实验发现CD36可以与INSIG2相互作用。进一步PLA实验发现,CD36OE细胞中SCAP与INSIG2的结合降低,表明CD36竞争性抑制SCAP与INSIG2的结合。在Hep G2细胞中,CD36敲低抑制SREBP1通路的激活,而INSIG2敲低解除了CD36敲低对SREBP1通路的抑制作用。同样,SREBP1/SCAP复合物抑制剂25-HC或betulin逆转了CD36过表达所诱导的SREBP1裂解和脂质生成基因表达。结论:CD36受到营养信号的上调,通过与INSIG2结合,促进SREBP1裂解和肝脏DNL,从而促进NAFLD的发生发展。靶向肝细胞CD36可能成为治疗NAFLD的潜在策略。