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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年期的中枢神经系统(central nervous system,CNS)退变性疾病,PD的主要病理改变是黑质致密区(substantia nigra pars compacata,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性、死亡,残存神经元胞浆内嗜酸性包涵体即Lewy小体(Lewy’sbody,LB)形成,导致纹状体多巴胺(Dopamine,DA)含量下降。患者纹状体区多巴胺含量下降到70-80％时,会出现典型的临床症状为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍等锥体外系症状[1]。因此保护黑质多巴胺能神经元,增加多巴胺含量,能够改善患者症状。目前临床上常用的治疗药物主要对症治疗,并不能阻止疾病进展。
PD的病因和发病机制目前尚不清楚。目前研究表明以DA氧化代谢为核心的氧化应激和老化相关的抗氧化系统缺陷可能是多种病因因素导致PD患者黑质DA能神经元选择性死亡的共同通路。动物实验和临床研究发现发现某些抗氧化保护线粒体功能药物可能增加酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表达,增加TH阳性细胞数,对DA能神经元具有保护作用,可能对PD有治疗保护作用。大量研究显示现有的药物及治疗方法不能满足人们的需求,因而开发能有效改善PD症状延缓疾病进展并具有神经保护作用的新药物是PD治疗研究热点。
在我们课题组中药防治PD的研究基础上,我们首次探讨了中药成份远志皂苷的对PD的作用。远志皂苷(tenuigenin)是中药远志中提取的活性成份,其主要成分为甾体类化合物。其中环戊烷并α氢化菲骨架以仅有1个环增加1个或两个原子予以改变。目前已发现它具有抗阿尔茨海默病(Alzhimer’disease,AD)、抗衰老、抗氧化、抗炎等多种生物活性。研究表明远志皂苷对抗β淀粉样蛋白诱导的基底前脑胆碱能神经元的损伤,远志皂苷对老年性痴呆的胆碱能系统功能减退有一定的改善和治疗作用.远志皂苷具有改善AD动物模型的认知和行为,并能改善健康成人和老年人的学习记忆能力[3]。远志皂苷能通过提高SOD,GSH,CAT等抗氧化指标保护过氧化氢损伤的PC12细胞,并能保护谷氨酸损伤的神经细胞与Aβ损伤的原代皮层神经元细胞。
远志皂苷有明显的抗老化抗氧化作用,那么对于同样神经变性病的帕金森病作用如何呢?远志皂苷对DA能神经元是否具有神经保护作用,其作用机制如何?国内外尚未见报道。。本研究,我们首先建立氧化应激诱导的PD模型,从离体和整体两个方面,对远志皂苷是否具有对PD模型的治疗作用及对DA神经的保护机制进行了初步的实验观察与分析。结果如下:
1.离体实验：
以神经毒素6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)损伤SH—SY5Y细胞；1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)为工具药处理MN9D细胞,建立两种PD细胞损伤模型。用不同浓度的远志皂苷与6-OHDA损伤的SH—SY5Y细胞模型和MPP+作用的MN9D细胞模型共孵育,观察远志皂苷对6—OHDA所损伤的SH—SY5Y细胞及MPP+所致MN9D细胞毒性作用的影响,并采用司雷吉兰(selegiline SEL)作用阳性对照药物,结果发现:
1.1.不同浓度的6-OHDA作用于SH—SY5Y细胞,不同浓度的MPP+作用于MN9D细胞12h-48h,可以诱发细胞损伤,MTS法检测细胞活力下降,细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量增加,其毒性作用呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性；25μ M6-OHDA作用SH—SY5Y细胞24h或50μ MMPP+作用MN9D细胞36h的损伤效应细胞活力下降50％,适于进行神经保护性药物筛选；
1.2.不同浓度的远志皂苷孵育SH—SY5Y、MN9D细胞24 h和48h,用MTS法检测细胞活力,发现1×10-9-10-3M远志皂苷孵育24 h不影响细胞活力;
1.3.1×10-7-10-5M远志皂苷预孵育SH—SY5Y细胞1h,再加入6-OHDA(25μ M)共同孵育SH-SY5Y细胞24 h或36h,远志皂苷可以拮抗6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞活力下降和LDH释放增加,其中1×10-5M的远志皂苷最明显,取此浓度为最佳保护浓度；5×10-7-5×10-5M远志皂苷预孵育MN9D细胞1h,再加入MPP+(50μ M)共同孵育MN9D细胞24 h或36h,远志皂苷可以拮抗MPP+诱导的MN9D细胞活力下降和LDH释放增加。其中5×10-5M远志皂苷效果最佳,以次浓度作为保护治疗药物浓度。
1.4.25μ M6-OHDA孵育SH—SY5Y细胞和50μ M MPP+孵育MN9D细胞12h或24h,检测发现细胞内氧化应激水平明显增强,GSH、SOD、CAT明显下降,远志皂苷能明显增加6-OHDA、MPP+所致的细胞内SOD GSH CAT的含量。
1.5.25μ M6-OHDA孵育SH—SY5Y细胞和50μ M MPP+孵育MN9D细胞3h可以明显导致细胞线粒体膜电位的下降。而远志皂苷能改善线粒体膜电位的下降,并能够降低凋亡因子Bax的蛋白表达增加抗凋亡因子Bcl-2的表达,同时能抑制Caspase-3的激活,降低其蛋白表达的含量。并增加了细胞TH蛋白的表达。
1.6.采用Real—time PCR检测了TH,caspase-3,Bax,Bcl-2的mRNA水平。结果发现远志皂苷能增加Bcl-2/Bax的比值,降低了caspase-3mRNA水平。增加了THmRNA的水平。说明TEN在转录水平上具有调节作用。
1.7.远志皂苷与阳性对照药物司雷吉兰相比较,对PD细胞模型的保护作用相当。并说明试验体系稳定。
2.整体实验：
以MPTP为工具药建立PD小鼠模型。远志皂苷(25mg/kg和50mg/kg)腹腔注射(i.p.)给药,每天1次,第11d给药1h后给予MPTP—HCL(20mg/kg,i.p.,连续4次,每次间隔2h),继续远志皂苷治疗,观察其对MPTP小鼠行为学、纹状体DA及其代谢产物的含量、黑质DA能神经元数量、黑质纹状体酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表达和黑质氧化应激水平的影响;
2.1.RotaRod转棒仪检测MPTP小鼠的运动协调能力,发现远志皂苷(50mg/kg,i.p.)可显著提高MPTP小鼠的转棒上停留时间,提示远志皂苷可以明显改善MPTP小鼠的运动协调能力;应用Truscan2.0动物活动监测系统记录60min内小鼠的自主活动情况,发现远志皂苷(50mg/kg,i.p.)可显著提高MPTP小鼠的总活动距离、平均活动速度和每次活动的平均移动距离,提示远志皂苷可以明显改善MPTP小鼠的自主活动减少。
2.2.高效液相-电化学检测法(high performance liquid chromatography—electrochemical detection,HPLC—ECD)检测纹状体DA及其代谢物含量,发现远志皂苷(25mg/kg和50 mg/kg,i.p.)可以提高MPTP小鼠纹状体DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxy phenylacetic acid,DOPAC)的含量,逆转(DOPAC+HVA)/DA的异常增高,降低DA的代谢更新率；
2.3.用TH免疫组化染色方法观察了黑质DA能神经元的数目,结果显示,远志皂苷(50mg/kg,i.p.)处理后,MPTP小鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元数目由生理盐水(NS)对照组的37.6％升至56.6％(p<0.05)；
2.4.Western蛋白免疫印迹法检测MPTP小鼠纹状体和中脑黑质TH蛋白表达情况,发现远志皂苷(50mg/kg,i.p.)可以有效对抗MPTP所致小鼠纹状体和中脑黑质TH蛋白表达减少(p<0.05)；远志皂苷能降低黑质部位Bax蛋白表达,增加了Bcl-2的蛋白表达,增加Bcl-2/Bax的比值。
3.结论：
3.1.首次在离体和整体PD模型中证实了远志皂苷对多巴胺能神经元具有明确的神经保护作用；
3.2.离体和整体实验均证明远志皂苷的对多巴胺能神经细胞的保护作用,作用机制可能为清除自由基和提高抗氧化系统的活性,保护线粒体膜电位,进而保护线粒体功能,抑制了线粒体凋亡有关因子的表达；远志皂苷能够增加脑内单胺类递质的含量,改善PD动物的行为。
3.3.治疗剂量的远志皂苷具有良好的安全性；
3.4.本研究显示天然植物药物远志皂苷对PD实验模型的DA能神经元具有明确的保护作用,沿这一方向继续深入研究可能会开发出具有中国自主知识产权的神经保护药物,为防治PD等神经退行性疾病提供新的选择。