背景:抑郁症发生机制复杂,其分子水平的发病机理尚不明确,一线治疗药物应答率有限。中药多途径、多靶点的协同作用特点,对于提高抗抑郁治疗效率和抑郁药新靶点的选择具有重要的引导和推动作用。开心散是唐宋以来中医传统益气养心、安神定志的代表方和基本方,课题组前期已在经典抑郁动物和细胞模型进行了深入的药效物质基础和作用机制的研究,但尚未在临床水平发现和验证其成药制剂参志茶的效应机制和有效靶点。目的:参志苓是经典抗抑郁古方开心散的中药成药制剂,本研究旨在临床水平采用系统生物学方法筛选参与抑郁病理生理进程的分子标记物和参志苓的作用靶点,以期基于临床疗效阐明参志苓抗抑郁的分子作用机制和相关生物学途径。方法:采集“参志苓片随机、双盲双模拟、阳性药平行对照治疗轻/中度抑郁症的有效性和安全性临床试验”受试者的外周血样本,选取抑郁症首发未用药和参志茶治疗8周显效患者的血清样本,并匹配健康对照,通过生物信息学分析筛选出在血清中差异表达的miRNAs,并遴选与抑郁和参志苓抗抑郁作用相关的目标miRNAs进行RT-PCR验证,从而在转录后调控水平寻找潜在的分子治疗靶标。基于miRNA表达谱中发现新的分子靶标miR-1281,在体外培养的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系中,建立皮质酮损伤体外模拟抑郁模型并予以不同浓度开心散处理,以考察miR-1281及其预测的靶基因在神经细胞中的表达情况及开心散的干预作用;通过双萤光素酶报告基因的方法分别检测miR-1281对野生型/突变型ADCY1和DVL1的降解能力,验证miR-1281对ADCY1和DVL1的靶向调控作用;构建miR-1281过表达的慢病毒表达载体,并予以不同浓度开心散处理,采用CCK8法、流式细胞术、PCR等方法,研究miR-1281表达水平的变化对神经细胞增殖、凋亡等细胞表型以及靶基因的影响;采用western blot检测miR-1281过表达对cAMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路靶蛋白的影响。采用蛋白质组学非标记定量(Lable-free)技术结合LC-MS/MS的方法,检测健康对照组、抑郁症首发未用药组和参志苓治疗8周显效患者的血清样本,通过生物信息学分析筛选出在血清中差异表达的蛋白,然后遴选与抑郁和参志茶抗抑郁作用相关的关键差异靶蛋白进western blot验证,并解析相关的生物学途径。基于蛋白组学结果的提示,采用比浊法原理对参志茶体外抗血小板聚集活性(THR、ADP、AA、COLL为诱导剂)进行评价,采用竞争性酶联免疫吸附法测定参志茶对凝血酶诱导的血小板cAMP含量和5-HT的影响,以及健康对照、抑郁症、参志苓服用8周显效患者血清样本中BDNF和5-HT的含量,采用荧光分光光度法测定参志苓对静息状态和凝血酶诱导的血小板Ca2+离子含量的影响,采用western blot分别测定参志茶对凝血酶诱导的血小板BDNF蛋白表达水平的影响,并在临床水平测定HC、DP、SZL三组血清样本中凝血酶原的表达情况,采用血凝仪检测参志苓给药前后患者血浆样本的凝血五项变化。结果:通过高通量基因芯片筛选的方法,筛选出在临床外周血清样本中差异表达的miRNAs,在抑郁患者中共鉴定出112个差异具有显著性的miRNAs,其中23个上调,89个下调;与抑郁患者给药前相比,在参志苓给药8周后共鉴定出46个个差异具有显著性的miRNAs。两者取交集,共有45个miRNAs表达差异显著,其中17个上调,28个下调,既可能是抑郁症发病的生物标记物,又可能是参志茶抗抑郁的作用靶标。然后使用实时荧光定量PCR扩大血清样本验证了交集中10个差异表达的候选目标miRNAs,有6个miRNA(miR-1281、miR-365a-3p、miR-2861、miR-16-5p、miR-1202、miR-451a)的表达与芯片检测结果一致,其中miR-1281在抑郁患者中高表达,表达水平约为正常对照的4倍,而在参志茶给药后下调,组间差异显著,且microRNA-gene-pathway-net分析显示miR-1281网络赋值较高,预测其能调控的靶基因多为与抑郁相关的经典信号通路上的关键节点,提示miR-1281的调控异常可能与抑郁发病和参志茶抗抑郁作用相关。进一步细胞功能学实验显示,皮质酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中miR-1281表达水平升高,而其预测的靶基因ADCY1和DVL1表达水平降低,开心散干预后呈剂量相关性同时反向减低/升高。转染突变型ADCY1和DVL1质粒组的HEK293细胞内ADCY1和DVL1的水平明显高于野生型质粒组,说明野生型ADCY1和DVL1可与miR-1281特异性结合并被降解,ADCY1和DVL1可能是miR-1281的靶基因。转染miR-1281慢病毒后SH-SY5Y细胞存活率降低并凋亡明显,开心散干预后存活率显著增加,并明显抑制细胞早期凋亡。同时在miR-1281过表达的SH-SY5Y细胞系中,ADCY1mRNA和DVL1mRNA表达水平下调,由ADCY1介导的cAMP信号通路上的PKA、pERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF蛋白水平明显降低,开心散干预后蛋白水平呈剂量相关性显著性增高,而由DVL1介导的Wnt信号通路上的GSK-3β蛋白表达水平增高,pGSK-3β和β-catenin蛋白表达水平降低,开心散干预后表达水平也发生反向变化。通过Lable-free联合LC-MS/MS总共鉴定出878种蛋白质,与健康对照相比,抑郁患者组有31种蛋白质呈显著性差异表达(>1.5或<0.67倍,p<0.05),其中又有12种蛋白质在参志苓给药8周后表现出反转表达趋势,组间差异具有显著性。这12种蛋白质的细胞定位集中在富含血小板α颗粒,通路富集于血小板脱颗粒、血小板胞质Ca2+升高、补体和凝血级联、血小板活化等,随后我们通过western blot进一步验证了 VWF、SERPINA1、APOC3、A2M表达水平的动态变化与蛋白谱一致。基于蛋白质组学的研究结果提示,我们进一步考察了不同浓度的开心散对THR、ADP、AA、COLL诱导的人血小板聚集抑制作用,发现与空白对照组相比,KXS可呈剂量依赖性的显著抑制THR和ADP引起的血小板聚集,对COLL诱导的血小板聚集仅在KXS高浓度时体现出微弱的抑制作用,而对AA诱导的血小板聚集基本没有抑制作用。在使用Fura-2荧光标记示踪观察KXS对凝血酶激活的血小板胞浆游离钙动员的影响时发现,150μg/mL的KXS提取物不论在有无外钙存在的条件下,均能够使凝血酶诱导血小板胞浆内Ca2+水平显著降低。通过KXS对血小板聚集过程中核苷酸系统、内含释放物影响的研究也证实,不同浓度KXS体外孵育可显著增加血小板cAMP水平,抑制凝血酶诱导的血小板活化所致BDNF的释放,降低血小板5-HT的含量。同时,其成药制剂SZL可在临床水平增加抑郁患者血清BDNF水平,降低血清凝血酶原和5-HT水平,但对凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、国际标准化比值比无影响。结论:基于RCT临床研究的外周血样本开展了经典古方开心散成药(参志茶片)的转录后调控和蛋白质组学研究,筛选并验证了与抑郁发生和参志茶抗抑郁作用相关的差异miRNAs和靶蛋白,发现了 miR-1281是在外周临床样本中被鉴定出来的一种新的可能与抑郁和参志茶抗抑郁作用相关的微小RNA,同时蛋白组学研究显示参志茶抗抑郁的生物学途径与血小板活化、脂质代谢、凝血级联和免疫应答有关,并对VWF、SERPINA1、APOC3等与心血管相关的蛋白表达有明显的影响,提示其参与了对抑郁患者心血管功能的调节作用。基于临床水平miRNA表达谱的发现,通过体外研究阐明了过表达miR-1281对神经细胞具有损伤作用,开心散可能通过下调miR-1281水平同时靶向ADCY1和DVL1,从而激活cAMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路来发挥神经细胞保护作用;基于临床水平蛋白质组学的发现,初步探讨了开心散发挥抗抑郁作用的另一种可能机制一抑制凝血酶诱导的血小板活化,并通过体外研究初步阐明了开心散是通过抑制血小板内钙释放、外钙内流和降低cAMP水平发挥抑制活化作用,并能够影响血小板BDNF的分泌和生成、降低血小板5-HT含量,与前期蛋白组学研究结果相吻合,这可解释开心散通过影响血小板功能发挥抗抑郁的生物学效应。提示开心散在调控抑郁症相关分子网络的同时,对抑郁导致心血管疾病的共病机制之一血小板活化也显示出调控效应,并在临床水平未见相关出血风险,可能成为治疗双心疾病的潜在优选药物。