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失血性休克是由战伤或创伤所引起的严重并发症,是导致多器官功能障碍的重要原因,其特征是失血和缺氧。失血性休克患者出现组织缺氧、毛细血管渗漏和微循环障碍的关键环节是血管通透性增高[1],是失血性休克导致器官功能障碍的重要发病机制。多器官功能障碍是失血性休克后缺血再灌注损伤的后果,是创伤患者死亡的主要原因。因此,寻找有效治疗失血性休克致血管屏障功能障碍的措施,对降低失血性休克患者的后期死亡率具有重要意义。周细胞是位于毛细血管壁外侧的一种壁细胞,紧贴内皮细胞[2]。其细胞突触呈放射状,与多个内皮细胞连接,盘踞在毛细血管壁上,周细胞在内皮细胞上的覆盖率对血管通透性起着决定性的作用[3]。周细胞与内皮细胞间连接对血管的形成、稳定及渗漏等方面起至关重要的作用。周细胞是否对失血性休克血管屏障功能障碍具有保护作用,不清楚。Cx43是缝隙连接的主要构成蛋白,缝隙连接通过形成可渗透的细胞间通道,在细胞间通信中发挥重要作用。缝隙连接参与调控血管功能,介导细胞间电化学信号的传导[4]。Cx46,Cx45,Cx43,Cx40和Cx37是主要分布于心血管系统中的缝隙连接蛋白,它们参与心血管系统的快速协调运动,同时也参与多种心血管疾病的发生发展过程[5-6]。既往研究发现,Cx43在高血压、动脉粥样硬化等多种血管疾病中发挥重要作用[7-8]。周细胞与内皮细胞间的缝隙连接蛋白Cx43是否影响周细胞对休克血管渗漏的改善作用,目前尚不清楚。本研究采用失血性休克大鼠和Cx43条件性敲基因小鼠,观察PC与VEC间的Cx43是否影响周细胞在血管上的定植,是否参与调节周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用。【研究内容】第一部分:失血性休克大鼠周细胞数量的变化与血管通透性变化的关系利用失血性休克大鼠模型,以肺血管及肠系膜微血管为研究对象,研究失血性休克大鼠周细胞数量的变化与血管通透性变化的关系。采用肺组织对伊文思蓝（Evans Blue,EB）和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的透过率及以肠系膜微血管为代表的微循环对FITC-BSA透过率的方法,观察失血性休克后血管通透性的变化。通过透射电镜（Transmission Electron Microscopy,TEM）和免疫印迹（Western Blotting,WB）等方法观察周细胞数量的变化,观察肺泡间中性粒细胞浸润的情况。了解失血性休克后肺血管通透性变化与周细胞数量变化的关系。第二部分:周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用整体动物水平按文献方法[9]提取视网膜周细胞,采用免疫荧光和流式细胞术鉴定培养的周细胞,培养的周细胞用于治疗失血性休克大鼠（PC=106/只）。以肺血管和肠系膜微血管为研究对象,采用肺组织对EB和FITC-BSA的透过率及以肠系膜微血管为代表的微循环对FITC-BSA透过率的方法,观察周细胞治疗后失血性休克大鼠血管通透性的变化。观察肺泡间中性粒细胞浸润的情况,通过透射电镜和WB等方法观察周细胞治疗后大鼠肺血管周细胞数量、内皮细胞间紧密连接结构的变化,了解周细胞是否能调节血管内皮屏障功能,降低失血性休克血管通透性。细胞水平将周细胞与血管内皮细胞共培养后,采用检测细胞跨膜电阻（Transepithelial Electrical Resistance,TER）和FITC-BSA透过率等方法,观察周细胞对缺氧血管内皮细胞通透性的保护作用。第三部分:周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用与Cx43的关系（一）调控周细胞Cx43的表达对周细胞保护失血性休克血管通透性的影响整体动物水平培养的周细胞（干扰/过表达Cx43）用于治疗到失血性休克大鼠。以肺血管和肠系膜微血管为研究对象,采用肺组织对EB和FITC-BSA的透过率及以肠系膜微血管为代表的微循环FITC-BSA透过率的方法,观察调控周细胞Cx43的表达对周细胞保护失血性休克血管通透性的影响。观察肺泡间中性粒细胞浸润的情况。通过透射电镜和WB等方法观察周细胞（干扰/过表达Cx43）治疗后大鼠肺血管周细胞数量、内皮细胞与内皮细胞间紧密连接结构的变化。了解周细胞对失血性休克大鼠血管通透性的作用与周细胞Cx43的关系。细胞水平在Transewell膜一侧培养周细胞（干扰/过表达Cx43）,另一侧培养血管内皮细胞,VEC与PC的比率为10:1,检测血管内皮细胞的TER值、FITC-BSA透过率和血管内皮细胞连接蛋白（VE-cadherin和ZO-1）表达的变化,明确周细胞对缺氧内皮屏障功能及内皮细胞间连接的保护作用与周细胞Cx43的关系。（二）敲除小鼠血管内皮细胞的Cx43对周细胞保护失血性休克血管通透性的影响构建血管内皮细胞Cx43敲基因（Tie2-Cre;Cx43 flox/+）小鼠并进行鉴定。利用血管内皮细胞Cx43敲基因（Tie2-Cre;Cx43 flox/+）小鼠及野生型（Wild Type,WT）小鼠,复制失血性休克（30mm Hg 3h）小鼠模型,失血量约50%,以肺血管和肠系膜微血管为研究对象,采用肺组织对EB和FITC-BSA的透过率及以肠系膜微血管为代表的微循环FITC-BSA透过率的方法,观察小鼠血管内皮细胞Cx43条件性敲除后对周细胞在血管内皮定植的影响,进而影响周细胞保护失血性休克血管通透性的作用。【研究结果】第一部分:失血性休克大鼠血管周细胞数量的变化与血管通透性变化的关系失血性休克后,血管周细胞逐渐脱落,数量明显减少,肺血管PDGFR-β和NG-2的表达均降低;肺血管和以肠系膜微血管为代表的微循环通透性明显增加;透射电镜结果显示,血管内皮细胞间紧密连接破坏,细胞肿胀,结构破坏;WB结果显示,肺血管VE-cadherin和ZO-1的表达明显降低;肺泡间中性粒细胞浸润增加。研究结果提示,失血性休克后周细胞数量减少,肺血管及肠系膜微血管通透性增高,周细胞的数量与血管通透性呈负相关。第二部分:周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用结果显示,输注的周细胞可定植于肺血管,并在输注12h后定植最多。透射电镜和WB结果显示,周细胞治疗后,失血性休克血管内皮细胞间紧密连接结构明显改善;肺血管内皮粘附连接（VE-cadherin）和紧密连接（ZO-1）的表达明显增加;肺泡间中性粒细胞浸润明显改善。研究结果提示,输注的周细胞可定植于血管上,增加血管的物理覆盖,显著降低失血性休克大鼠肺血管及肠系膜微血管通透性,对失血性休克大鼠的血管内皮屏障功能具有保护作用。细胞水平结果显示,血管内皮细胞缺氧处理后TER值降低,内皮细胞对FITC-BSA的透过率增加,缺氧内皮细胞ZO-1和VE-cadherin的表达降低;周细胞可使缺氧内皮细胞TER值增高,FITC-BSA透过率降低,内皮细胞ZO-1和VE-cadherin的表达显著上调。上述结果提示,缺氧处理后,血管内皮细胞连接蛋白的表达降低,细胞通透性增高,周细胞可上调内皮细胞连接蛋白的表达,降低缺氧血管内皮细胞的通透性。第三部分:周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用与Cx43的关系（一）调控周细胞Cx43的表达对周细胞保护失血性休克血管通透性的影响调控周细胞Cx43的表达后用于治疗失血性休克大鼠,结果发现干扰周细胞Cx43后,输注的周细胞在肺血管上的定植明显减少,对失血性休克大鼠肺血管及肠系膜微血管通透性的改善作用减弱;对失血性休克血管内皮细胞紧密连接结构的改善作用减弱,肺血管ZO-1和VE-cadherin的表达明显减少。周细胞过表达Cx43后输注的周细胞在肺血管上的定植明显增加,对肺血管及肠系膜微血管通透性的保护作用增强;对失血性休克血管内皮细胞紧密连接结构的改善作用增强,肺血管ZO-1和VE-cadherin的表达显著增多。采用血管内皮细胞缺氧模型。干扰Cx43表达的周细胞处理后,周细胞和内皮细胞间直接接触比例减少,内皮细胞ZO-1和VE-cadherin的表达均降低,内皮细胞的TER值降低,对FITC-BSA透过率增加;周细胞过表达Cx43后,周细胞和内皮细胞间直接接触比例增加,细胞间接触的面积增加,内皮细胞ZO-1和VE-cadherin的表达均增加,内皮细胞的TER值增加,对FITC-BSA透过率降低。上述结果提示,干扰周细胞的Cx43可减弱周细胞对缺氧血管内皮细胞连接蛋白的改善作用,减弱周细胞对缺氧血管内皮细胞通透性的保护作用,过表达周细胞的Cx43可增强周细胞对缺氧血管内皮细胞连接蛋白的改善作用,增强周细胞对缺氧血管内皮细胞通透性的保护作用。（二）小鼠血管内皮细胞Cx43敲除对周细胞保护失血性休克小鼠血管通透性的影响血管内皮细胞Cx43条件性敲除后,输注的周细胞在肺血管的定植明显减少,周细胞对失血性休克肺血管及肠系膜微血管通透性的保护作用减弱,肺血管ZO-1和VE-cadherin的表达明显减少。【结论】1.失血性休克后肺血管周细胞脱落,数量减少,周细胞在血管上的覆盖率显著降低,内皮细胞肿胀、紧密连接结构破坏,肺血管及肠系膜微血管通透性增加,失血性休克后周细胞数量与血管通透性呈负相关。2.周细胞可显著降低失血性休克肺血管及肠系膜微血管通透性,表明周细胞在失血性休克血管通透性的调控中有重要作用。3.周细胞与血管内皮细胞间的缝隙连接蛋白（Cx43）可影响周细胞在血管上的定植,进而影响周细胞对失血性休克血管通透性的保护作用。其机制可能一方面通过影响周细胞与血管内皮细胞间的直接连接的形成,另一方面通过影响粘附连接蛋白的表达进而影响周细胞与血管内皮细胞间的连接。