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[实验目的]本课题拟在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)联合培养的过程中观察是否BMSCs能分化为肠上皮样细胞;加入PI3K阻断剂后测定BMSCs中CK、Villin、AKT以及mTOR表达水平,探讨BMSCs能否通过PI3K/AKT/mTOR信号通过分化为肠上皮样细胞。[实验方法]1.从大鼠股骨和胫骨分离BMSCs,原代培养、传代;从细胞形态、流式细胞术、成脂诱导实验鉴定大鼠BMSCs。2.将实验分为BMSCs+IEC-6组和BMSCs+BMSCs组,利用Transwell上下层将BMSCs与IEC-6进行共培养3天、7天、10天,分别取3天、7天、10天共培养之后的BMSCs进行鉴定,免疫荧光法鉴定CK、Villin蛋白。3.利用Transwell进行共培养,将实验分为三组:BMSCs与IEC-6共培养组,另设BMSCs+IEC-6加入PI3K抑制剂LY294002,空白对照BMSCs+BMSCs组;共培养3天、7天、10天后用Western Blot检测CK、Villin、AKT、mTOR蛋白表达水平。4.分析 CK 与 AKT、CK 与 mTOR、Villin 与 AKT 及 Villin 与 mTOR 相关性。[实验结果]1.所培养的细胞呈梭形、漩涡状排列;具有对塑料培养瓶具有黏附性;表达细胞表型CD29,不表达造血细胞表型CD34;成脂诱导实验具有分化为脂肪细胞的能力,且增殖能力强,可鉴定为BMSCs。2.利用Transwell将BMSCs与IEC-6共培养之后,3天、7天、10天表达上皮细胞因子细胞角蛋白(CK),肠上皮细胞因子villin蛋白;共培养3天,BMSCs形态未发生明显变化;共培养7天,细胞形态部分发生变化,部分变成椭圆形;共培养10天,细胞大部分发生形态变化,由长梭形变圆形、椭圆形。3.Western Blot 结果 AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白表达水平:(1)共培养3 天:BMSCs+IEC-6、BMSCs+IEC-6+LY294002、BMSCs+BMSCs 三组比较差异具有统计学意义(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白在 BMSCs+IEC-6组高于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05);AKT 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组与BMSCs+BMSCs组比较差异无统计学意义(P>0.05),mTOR蛋白BMSCs+IEC-6+LY294002 组低于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05),CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组高于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05);AKT、mTOR、CK蛋白在BMSCs+IEC-6组与BMSCs+IEC-6+LY294002组比较差异具有统计学意义(P<0.05),Villin 蛋白在 BMSCs+IEC-6 组与 BMSCs+IEC-6+LY294002组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)共培养7天:BMSCs+IEC-6、BMSCs+IEC-6+LY294002、BMSCs+BMSCs三组比较差异具有统计学意义(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6 组高于 BMSCs+BMSCs组(P<0.05);CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组高于 BMSCs+BMSCs组(P<0.05),mTOR 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组低于 BMSCs+BMSCs组(P<0.05),AKT 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组与 BMSCs+BMSCs 组比较差异无统计学意义(P>0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白在 BMSCs+IEC-6组与BMSCs+IEC-6+LY294002组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)共培养 10 天:BMSCs+IEC-6、BMSCs+IEC-6+LY294002、BMSCs+BMSCs 三组比较差异具有统计学意义(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin蛋白BMSCs+IEC-6 组高于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05);AKT、mTOR 蛋白BMSCs+IEC-6+LY294002 组低于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05),CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组高于 BMSCs+BMSCs 组(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6 组高于 BMSCs+IEC-6+LY294002 组(P<0.05)。(4)BMSCs+IEC-6+LY294002组3天、7天、10天比较差异有统计学意义(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组 3 天高于7 天(P<0.05);AKT、mTOR、CK、Villin 蛋白 BMSCs+IEC-6+LY294002 组 3天高于 10 天(P<0.05);CK、mTOR 蛋白在 BMSCs+IEC-6+LY294002 组 7 天高于 10 天(P<0.05);AKT、mTOR 蛋白在 BMSCs+IEC-6+LY294002 组 7 天、10天比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.BMSCs+IEC-6+LY294002 组 3 天、7 天、10 天相关性分析:AKT 与 mTOR,相关系数r=0.989,P<0.05,AKT与mTOR存在正相关关系,AKT水平减少,mTOR 水平随之减少;AKT 与 villin,相关系数 r=0.730,P<0.05,AKT 与 villin存在正相关关系,AKT水平减少,villin水平随之减少;AKT与CK,相关系数r=0.684,P<0.05,AKT与CK存在正相关关系,AKT水平减少,CK水平随之减少;mTOR 与 villin,相关系数 r=0.686,P<0.05,mTOR 与 villin 存在正相关关系,mTOR水平减少,villin水平随之减少;mTOR与CK,相关系数r=0.634,P=0.067>0.05,暂不能认为CK与mTOR存在相关关系。[结论]1.全骨髓贴壁法能得到较纯的BMSCs,并能保持较好的细胞活性。2.BMSCs与IEC-6共培养后,BMSCs形态发生一定的变化,IEC-6能诱导BMSCs向肠上皮分化,并且能表达肠上皮细胞CK、Villlin蛋白。3.加入PI3K抑制剂LY294002后PI3K下游分子AKT、mTOR蛋白表达量下调,表明LY294002抑制剂能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。4.加入PI3K/AKT/rnTOR信号通路抑制剂LY294002后,CK、Villin蛋白表达随着时间的延长表达逐渐下降,结合AKT、mTOR、CK、Villin四个因子相关性分析,表明PI3K/AKT/mTOR信号通路能参与调节BMSCs的的分化。对进一步了解BMSCs参与治疗一些肠道疾病的机制具有一定的意义。