硫酸类肝素-3-0-磺基转移酶B1(HS3ST3B1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的下调作用

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目的:在HBV的生命周期中,HBV的复制是受到宿主和自身各种因素控制的。本课题旨在研究宿主因子HS3ST3B1对HBV复制的影响,并探讨可能的作用机制。方法:将HS3ST3B1与HBV表达质粒pCH9-HBV共转染HepG2细胞,利用Southern blot和实时聚合酶链式反应(Real-time PCR )技术检测过表达HS3ST3B1后HBV复制水平和总RNA水平的变化;同时,干扰过表达HS3ST3B1后,检测HBV复制水平和总RNA水平的变化;干扰内源性HS3ST3B1后,检测HBV复制水平的变化。在HBV稳定细胞株HepG2.H7中转染不同量HS3ST3B1,检测HBV复制水平的变化;利用双荧光素酶报告系统检测过表达HS3ST3B1后HBV启动子活性的改变,及干扰过表达的HS3ST3B1后HBV启动子活性的改变。结果:Southern blot显示:在HBV瞬时表达模型中,过表达HS3ST3B1后,HBV DNA水平有明显下降。RNAi干扰过表达HS3ST3B1后,HBV DNA水平则有所恢复;干扰内源性HS3ST3B1,HBV DNA水平有一定程度上升;在HBV稳定表达模型H7中,不仅进一步证实HS3ST3B1对HBV复制的下调作用,而且HBV DNA水平随着HS3ST3B1转染量增加而下降,呈现出HS3ST3B1的浓度依赖性。Real-time PCR显示:过表达HS3ST3B1后,HBV总RNA水平有明显下调,而干扰过表达HS3ST3B1后,HBV总RNA下调得到明显恢复;双荧光素酶报告系统结果显示:与过表达HS3ST3B1后,HBV四个启动子的活性均无明显差异,干扰过表达HS3ST3B1后,HBV四个启动子的活性亦无明显改变。结论:HS3ST3B1对HBV DNA和HBV总RNA都有下调,而HS3ST3B1对HBV总RNA水平的下调却不是HS3ST3B1抑制HBV启动子活性实现的。目的:建立特异性扩增cccDNA和rcDNA正链冗余序列区的方法及构建冗余序列区突变的HBV1.1倍体,为HBV冗余序列去除部位的研究奠定基础。方法: 1.从HBV稳定表达株HepG2.H7的培养上清中提取rcDNA,并设计引物,建立特异性扩增rcDNA正链冗余序列区的方法; 2.利用Hirt法从HBV稳定表达株HepG2.H7中提取cccDNA,设计引物,建立特异性扩增cccDNA冗余序列的方法;3.设计针对HBV冗余序列区的突变引物,利用定点突变技术构建突变HBV1.1倍体,从而使得rcDNA冗余序列区发生突变。结果:成功建立特异性扩增cccDNA和rcDNA正链冗余序列区的方法,并构建了冗余序列区突变的HBV1.1倍体,为构建突变HBV稳定表达株,确认冗余序列去除部位奠定了基础。
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