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目的:通过观察新生小牛视网膜神经细胞中微管相关蛋白MAP-1B的表达和分布情况,研究在不同因子的作用下,视网膜神经细胞及其突起可能出现的变化,探讨神经诱导因素对视网膜神经细胞生长和发育的影响及其可能机制,为治疗相关视网膜疾病提供依据。
材料与方法:以新生小牛视网膜为研究对象,传代培养视网膜神经细胞,对神经细胞进行免疫组织化学鉴定后,在细胞传二代后开始生长时即分别加入浓度为50ng/ml的BDNF;浓度为100ng/ml的CNTF;浓度为50ng/ml的bFGF;浓度为50ng/ml的NT-3。在神经细胞生长到2天,5天,7天时,从无菌室中取出,对培养的细胞进行免疫组织化学检测细胞内MAP-1B的表达和分布情况;提取细胞的总RNA进行PCR扩增检测MAP-1B在细胞生长过程中的表达及其含量,分析BDNF,CNTF,bFGF,NT-3作用于细胞2天,5天,7天后,微管蛋白MAP-1B的表达变化。
结果:研究发现,50ng/ml浓度的BDNF,100ng/ml浓度的CNTF,50ng/ml浓度的bFGF和50ng/ml浓度的NT-3均可对视网膜神经细胞的生长起到促进作用。
免疫组织化学检测观察发现,BDNF作用2天后,在胞体和突起上均可见明显的MAP-1B蛋白表达,2天时MAP-1B主要集中在核周,5天分布于离开核周的胞浆中,呈煎蛋状向外扩散分布,7天时向突起方向呈极性分部,但MAP-1B蛋白分部的位置有所不同,主要分部于细胞周边,对照组在胞浆内向离开胞核方向扩展和沿轴突呈极性延伸均较因子作用各组不明显。
CNTF作用2天后,细胞开始贴壁生长,细胞圆形和椭圆形的胞体和刚开始伸出的突起均有MAP-1B阳性表达,颜色较浅;5天时细胞中MAP-1B含量开始增多,细胞的突起开始较多伸展并相互开始连接,颜色有所加深,在距离细胞核稍远的胞浆中呈环形分布;CNTF作用7天后,细胞突起相互连接呈网状和片状,细胞中的MAP-1B在细胞中沿着突起延伸的方向呈极性分部。
bFGF作用2天后,细胞生长活性较好,圆形的胞体上开始伸出突起,围绕核膜分布;bFGF作用5天后,细胞突起开始形成相互连接,细胞中MAP-1B在细胞中的分布呈煎蛋状,在原有核周部位逐渐向外随细胞生长而扩展;bFGF作用7天后,细胞与细胞间的突起形成网状,有的形成片状,细胞MAP-1B沿着突起延伸的方向呈规律的极性分布,呈现线状平行排列。
NT-3作用2天后,细胞呈单个分散分布,有些细胞开始伸展,突起开始形成,MAP-1B沿胞核分布一周,其余整个细胞颜色较均一;NT-3作用5天后,细胞和细胞间开始形成连接,突起伸展开,原来细胞核周边分布较多的MAP-1B开始向胞浆中扩散分布,有明显的环形呈带状围绕细胞核一周;NT-3作用7天后,细胞突起相互连接呈网状、片状,MAP-1B沿着细胞和突起生长的方向开始呈极性延伸,显示出线状排列,分布趋势明显。
对照组作用2天后,细胞贴壁生长,大部分呈圆形或椭圆形, MAP-1B分布比较均匀,胞核周围有较胞浆中较多的MAP-1B,但颜色较淡;5天后细胞突起开始伸展,有细胞和细胞间连接形成, MAP-1B主要集中在细胞核周围,有少量散在在胞浆中;7天后,细胞开始广泛形成突起间的相互连接,MAP-1B在整个胞浆中弥散分布,极性不明显,分布趋势不明显。
提取RNA进行PCR检测观察到,作用2天时,结果显示MAP-1B的cDNA表达含量增加,BDNF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.34±0.03,CNTF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.37±0.02,NT-3组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.33±0.01,bFGF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.49±0.02,较对照组目的基因与内参照基因的表达强度之比0.17±0.01明显增加。
作用5天后,细胞内MAP-1B基因表达量持续增加,BDNF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.38±0.01,CNTF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.49±0.01,NT-3组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.63±0.01,bFGF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.54±0.03,明显高于对照组目的基因与内参照基因的表达强度之比0.19±0.01。
作用7天后,细胞内MAP1B基因含量仍继续增加,BDNF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.48±0.03,CNTF组作用7天后,细胞内MAP-1B与内参表达强度之比为0.61±0.01,NT-3组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.70±0.02,FGF组目的基因与内参照基因的表达强度之比为0.65±0.04,明显高于对照组目的基因与内参照基因的表达强度之比0.22±0.01。
结论:(1)细胞在因子作用后所表达的MAP-1B增多,MAP-1B是视网膜神经细胞生长和突起延伸过程中特异性较强的蛋白,其表达的增多反映出细胞活性的增加和细胞突起生长的活跃,表明了因子对细胞生长的促进作用。
(2)在因子作用下,MAP-1B分布的部位呈现较明显的规律:起始时主要集中在核周,随时间的推移MAP-1B分布逐渐远离细胞核呈离心生长,之后呈极性分布;而对照组与因子作用后的各组相比较,MAP-1B的分布规律性不显著,这表明实验的各因子对MAP-1B的分布和神经细胞突起生长趋势存在影响。
总之,50ng/ml浓度的BDNF,100ng/mlCNTF,50ng/ml bFGF和50ng/ml的NT-3对小牛视网膜神经细胞的生长起促进作用,为临床视网膜退行性疾病和神经细胞损伤疾病的治疗提供参照。