基于等温扩增技术快速检测红菇属中两种有毒蘑菇的研究

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蘑菇中毒是我国食物中毒中死亡率最高且死亡人数最多的突发公共卫生事件之一,对有毒蘑菇进行快速准确的鉴定对蘑菇的中毒预防和中毒后的准确有效治疗具有至关重要的作用。在我国蘑菇中毒导致的死亡事件中,除误食剧毒鹅膏菌或含鹅膏毒肽的环柄菇属、盔孢伞属物种引起外,主要由误食亚稀褶红菇Russula subnigricans引起;亚稀褶红菇已成为致命的剧毒蘑菇之一。同时,近年来在我国导致胃肠炎型症状的毒蘑菇中毒事件中,日本红菇R.japonica导致的中毒案例数连年高居第二。由于红菇属物种种类多,有毒物种和一些可食物种形态相似,很难从形态上区分开来,给物种鉴定带来困难,而常规的DNA条形码鉴定进行物种测序,需要较长的时间。因此,为了更为快速准确地检测和鉴定红菇属有毒蘑菇,本文以内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶标设计引物,对亚稀褶红菇和日本红菇的等温扩增分子检测方法的建立展开了研究,主要结果如下:1.建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的反应体系并对其进行优化。LAMP最佳反应体系为:镁离子终浓度为6 m M,羟基萘酚蓝(HNB)终浓度为180μM,Bst DNA聚合酶终浓度为0.24 U/μL。反应体系在62°C反应45-60 min即能有理想扩增效果,基于HNB染色法的可视化体系呈天蓝色。2.基于LAMP技术,针对亚稀褶红菇和日本红菇设计了LAMP特异性引物,实现了对亚稀褶红菇和日本红菇的物种特异性检测。结果表明LAMP技术能快速有效地实现红菇属内不同亚属物种之间的特异性区分,亦能对亲缘关系接近的同一组内的物种(黑色组section Nigricantinae)进行区分。基于PCR反应原理设计亚稀褶红菇物种特异性PCR引物,结果表明传统PCR不能对其组内物种进行有效区分,LAMP反应较传统PCR特异性更强。基于HNB染色法的LAMP技术的DNA分子检测限为10 pg,琼脂糖凝胶电泳法则可达1 pg;PCR的DNA分子检测限为100 pg。故而LAMP技术能灵敏地实现对日本红菇和亚稀褶红菇的特异性检测。3.基于超分支滚环扩增技术(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA),针对R.japonica设计了特异性锁式探针(padlock probe,PLP),实现了对R.japonica的物种特异性检测。基于SYBR GreenⅠ染色法的可视化体系呈黄绿色。
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