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背景自噬是细胞在受到应激的情况时,为自己的生存提供物质代谢所需的能量；或是正常情况下,自身器官正常新陈代谢的一种方式。据报道,自噬的发生与肿瘤的形成和发展有很大关系。BCL-3属于IκB家族蛋白,它在NF-κB信号通路中起着重要的调控作用。另外,BCL-3在血液肿瘤和实体肿瘤中过度或者是失控的表达会促进肿瘤的形成。目前有研究指出,BCL-3的表达会在一定程度上影响自噬,但是,对于BCL-3是如何影响自噬的过程,目前尚未明确。目的通过体外实验研究,BCL-3的表达对雷帕霉素(Rapamycin)诱导的细胞自噬的影响,并检测其相关蛋白,从而阐述BCL-3影响自噬的可能机制。方法1.细胞培养：Hela细胞培养于10%胎牛血清的DMEM(High Glusose)培养基中,在5%CO2培养箱中培养。平均约隔一天换一次培养液,注意调整细胞的密度尽量不超过1×106/mL。2.质粒的购买与提取：pGPU6/GFP/Neo-BCL-3-homo-558质粒购买于上海吉玛公司,该质粒是由上海吉玛公司构建的BCL-3的shDNA,靶序列为：GGGA GCTCGACATCTACAACA,其模板的序列为S：CACCGGGAGCTCGACATCT ACAA CATTCAAGAGATGTTGTAGATGTCGAGCTCCCTTTTTTG; A:GATCCAAA AAAG GGAGCTCGACATCTACAACATCTCTTGAATGTTGTAGATGTCGAGCTCCC。3.细胞转染：用lipofectamine 2000将shBCL-3质粒转染入Hela细胞,同时将NC-shRNA作为对照转入Hela细胞,转染后4-6h后完全更换含双抗、血清的新鲜培养基。转染24h后观察细胞荧光表达,然后提取蛋白。4.药物处理：使用浓度为1μM的rapamycin处理Hela细胞,使用Western blot的方法检测相关分子的变化情况。5.指标检测：在rapamyin处理组与未处理组的Hela细胞中提取蛋白,用Westernblot检测BCL-3、LC3等蛋白表达情况；质粒共转染及rapamycin等药物处理HeLa细胞后共聚焦显微镜观察HeLa细胞自噬关键蛋白LC3的表达及分布情况。结果验证BCL-3质粒和抗体,将NC和shBCL-3质粒分别转染入Hela细胞观察荧光、提蛋白做Western blot观察BCL-3表达量的变化。然后分组加药并提蛋白做western blot验证LC3抗体。1. Western blot结果和免疫共聚焦结果显示,用rapamycin诱导BCL-3干扰之后的Hela细胞发生自噬时,LC3水平较对照组会下降。2. Western blot结果显示,在rapamycin诱导BCL-3干扰之后的Hela细胞发生自噬时,Atg5蛋白在BCL-3干扰后,其蛋白表达量没有明显变化。3. Western blot结果显示,在rapamycin诱导BCL-3干扰之后的Hela细胞发生自噬时,Atg14和Vpsl5这两个蛋白的表达会受到影响。它们会随着BCL-3的干扰而下降。结论BCL-3对于雷帕霉素诱导的自噬,起到一定的调控作用,这种调控作用可能是通过非经典途径来实现的。