辣椒疫霉是一种世界性土传病害，辣椒疫病严重影响世界各国的辣椒生产，造成了巨大的经济损失。该病寄主范围广，可以侵染辣椒、西葫芦、黄瓜、茄子、番茄等20多种作物。近年来有关其发病机制、致病机理、防治策略等相关报道层出不穷，而从类似的致病菌中寻找有益基因为人类所利用却鲜有报道。2008年辣椒疫霉全基因组序列草图由美国能源部基因研究所公布于众（网址http://genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html）并不断更新完善。通过生物信息学分析，越来越多的人们感兴趣的基因得以被发现进而为揭示其相关功能并被人们所利用提供了便利。我们研究的类单胺氧化酶C类水合酶（MaoC-like hydratase，MaoC）即是在对其全基因组序列分析的基础上获得的一个新基因。MaoC在连接脂肪酸的β-氧化到聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）的生物合成过程中具有加水作用，是最近被发现的一种新型R型水合酶。全球化的环境问题使得人们越来越关注于可生物降解材料的开发与使用。在被研究中的可生物降解材料中，PHA以其所具有的生物降解性、生物相容性、热塑性和机械性能成为一种理想的“绿色塑料”替代物。所以，许多科学家正在尝试研制低成本高产出的PHA生产方案。PHA生产成本的降低可以使其成为那些在自然坏境中很难分解的传统塑料的理想替代物，即作为“绿色塑料”被使用。MaoC即是首先在大肠杆菌中被发现的一种新型R型水合酶，它在脂肪酸的β-氧化到PHA的生物合成过程中起重要作用：MaoC作为R型水合酶的新成员可以提供PHA合成的前体物质，R-3-酮酰基辅酶A。我们在辣椒疫霉菌中克隆到了一个新MaoC基因，获得了其蛋白晶体并解析了其高分辨率三维结构，以结构为基础对其功能进行了深入研究。具体总结如下：1.在致病菌辣椒疫霉中克隆到一个有益基因MaoC，对其进行了原核表达，并对表达出的重组蛋白利用亲和层析、阴离子柱交换层析、分子排阻层析等手段进行了纯化，得到了具有较高纯度的稳定重组蛋白；利用特异性的酶活实验以巴豆酰辅酶A为底物对重组纯蛋白进行了酶活测定，结果显示重组纯蛋白具有乙酰辅酶A水合酶活性，达到58.1U/mg，MaoC因其乙酰辅酶A水合酶活性而成为与PHA合成相关的众多酶类的一员，是一种新型的R型水合酶，为PHA的合成提供前体物质，R-3-酮酰基辅酶A；2.采用气相扩散悬滴结晶法获得了MaoC高质量蛋白晶体，并用分子置换法解析出分辨率达1.93的晶体结构；对其三维结构进行了细致描述与分析：MaoC具有R型水合酶类典型的结构折叠，分为明显的N-区域和C-区域，两个区域间由一个盐桥相连；具有典型的称为“热狗折叠”的保守结构域，并且N-区域不完整，而C-区域是完整的“热狗折叠”；MaoC通过四个α螺旋相互作用形成了同源二聚体结构，且参与二聚化作用的氨基酸在R型水合酶中是高度保守的；结构上的精细分析与比对还发现MaoC存在一段潜在的活性抑制片段；3.以序列和结构比对为基础，确定了MaoC的催化中心为以下三个氨基酸：D194、H199和G217。为了验证其催化作用我们做了三个定点突变：D194E、H199Q和G217A；对三个突变体重组蛋白进行了纯化，并对纯蛋白进行了圆二色性、蛋白杂交和分子排阻层析验证，以确定其分子量及蛋白的真实性等；酶活测定结果显示三个氨基酸中D194和H199对MaoC行使酶活性起重要作用，G217起次要作用，具体作用方式为：D194通过吸引催化水分子上的一个质子而激活水分子，活化了的水分子攻击底物巴豆酰辅酶A上的碳原子，同时H199对底物上的碳原子贡献一个质子以使反应顺利进行，而G217通过氢键作用与底物硫酯键上的碳酰基结合，起到稳定底物的作用；4.二聚体是MaoC的活性形式，MaoC通过四个α螺旋相互作用形成了同源二聚体结构。通过序列和结构比对分析发现，参与二聚化作用的氨基酸在不同的R型水合酶中是高度保守的，同时大部分已报道的R型水合酶结构均为二聚体结构，并且与MaoC具有类似的作用方式。基于结构上的分析与比对，我们推测二聚化作用对MaoC行使酶活性是必须的。为了验证这一推测，我们做了三个定点突变：R23D，M27E和L191D；对三个突变体纯蛋白进行分子排阻层析验证表明三个突变体均成功破坏了MaoC的二聚化作用，成为单体蛋白；酶活测定结果显示三个突变体单体蛋白均丧失活性，证实二聚化作用对MaoC行使酶活性是必须的；本研究首次通过生化实验证实二聚化作用对MaoC酶活起关键作用，考虑到二聚化作用在R型水合酶类蛋白上的普遍存在性，我们的结论即二聚化作用对其行使正常酶活是必须的可能对此类蛋白具有普遍适用性；一个单体结构可能会更好的解释其机制，然而我们对MaoC单体蛋白的结晶实验未能成功；5.以结构为基础我们对MaoC进行了酶工程改造，以期得到与野生型蛋白相比具有较高酶活的突变体。结构分析表明一段非保守的插入片段可能对MaoC的酶活调节起作用。如果我们的假设正确的话，删除此片段将会对MaoC的活性产生影响。基于此假设我们对此区域进行了定点突变与片段删除突变，并对纯化后的突变体重组蛋白进行了酶活测定，结果显示两个突变体分别有较大幅度的活性提高：突变体Del63-71酶活为91.2U/mg，约为野生型蛋白的1.5倍；突变体Del63-88酶活为126.7U/mg，约为野生型蛋白的两倍；而定点突变对MaoC酶活基本无影响；分子排阻层析实验表明突变体活性的增强与其聚合状态无关，因为两个活性增强突变体均为二聚体；我们的研究表明MaoC上非保守的插入片段对其活性有抑制作用。随着世界环境问题变得越来越严峻，发展绿色环保塑料以改善环境迫在眉睫。在本研究中，我们报道了一个与PHA生物合成相关的新型水合酶结构，并且对其活性调节机制进行了研究与改进，这些研究将为以更低的成本生产PHA提供有效信息。