论文部分内容阅读
研究目的:通过临床研究与体内外实验研究阐明健脾养正消癥方对胃癌有氧糖酵解水平及胃癌干细胞特性的影响,探索其可能的分子机制,以期揭示健脾养正消癥方治疗胃癌的机制。研究方法:1.所有晚期胃癌患者病例均来源于南京中医药大学附属医院江苏省中医院2019年02月到2020年2月份江苏省中医院肿瘤科门诊和住院患者,分为试验组(健脾养正消癥方+化疗)和对照组(化疗),其中对照组16例(男性10例,女性6例),试验组15例(男性13例,女性2例)。2组均连续治疗6周,上述病例患者分别在治疗前后抽血,使用乳酸检测试剂盒及乳酸脱氢酶检测试剂盒检测两组患者治疗前后血乳酸(LD)及乳酸脱氢酶(LDH)水平。2.采用MTT法观察健脾养正消癥方、顺铂单独与联合用药后对胃癌HGC-27细胞增殖抑制作用;采用菌落形成实验观察不同浓度健脾养正消癥方(2mg/ml,4mg/ml,8mg/ml)对胃癌HGC-27细胞克隆形成能力的影响;采用AnnexinV/PI双染法研究健脾养正消癥方胃癌细胞凋亡的影响。3.使用葡萄糖检测试剂盒及乳酸检测试剂盒检测健脾养正消癥方对胃癌细胞乳酸生成率及葡萄糖消耗率;Western blot法检测给药后有氧糖酵解代谢通路关键酶的蛋白表达。4.通过皮下注射胃癌HGC-27细胞建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,分组给药后观察裸鼠皮下移植瘤大小,裸鼠体重变化,乳酸脱氢酶检测试剂盒及乳酸检测试剂盒检测健康裸鼠及各组裸鼠血乳酸脱氢酶及乳酸水平。5.通过流式细胞术及细胞成球实验检测分析健脾养正消癥方对胃癌干细胞相关标记物及细胞成球能力的影响;Western blot法检测给药后胃癌细胞干性相关蛋白、有氧糖酵解代谢通路关键酶及其上游PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达。6.Western blot法检测给药后胃癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达。使用IGF-1作为PI3K/AKT/mTOR信号通路激动剂,检测IGF-1单独及联合健脾养正消癥方对胃癌细胞乳酸生成率、葡萄糖消耗率及细胞成球能力的影响。Western blot法检测给药后干性相关蛋白、有氧糖酵解代谢通路关键酶及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的变化。研究结果:1.对于晚期胃癌患者而言,在化疗的基础上使用中药能显著提高晚期胃癌患者KPS评分,而单纯化疗组治疗后KPS评分升高并不具有统计学意义,提示健脾养正消癥方对于改善患者治疗期间生活质量效果显著;2.从治疗效果的角度看,中药联合化疗组对比单纯化疗组有效率并无统计学意义;3.晚期胃癌患者血清有氧糖酵解指标乳酸脱氢酶及乳酸水平较正常人水平高,提示其代谢方式偏向于有氧糖酵解,而从治疗后的检测结果来看,单纯使用化疗药物使得患者体内有氧糖酵解水平提高,而在联合使用复方的情况下,患者体内相关指标降低,差异有统计学意义,提示健脾养正消癥方能降低晚期胃癌患者体内有氧糖酵解水平。4.健脾养正消癥方水提液(JPYZXZF)在体外能够抑制胃癌HGC-27细胞株活力,诱导细胞凋亡,降低克隆形成率,且呈浓度依赖性;低剂量JPYZXZF(1/3 IC50)在与化疗药DDP联合运用时,能够起到增加DDP化疗敏感性的作用;5.JPYZXZF能够降低胃癌细胞HGC-27肿瘤糖酵解水平,并对有氧糖酵解过程中关键酶的表达具有抑制作用;6.健脾养正消癥方能够对荷胃癌裸鼠皮下移植瘤具有抑制作用,并且能够改善肿瘤导致的体重减轻,改善其生活质量;和健康裸鼠比较,荷胃癌裸鼠体内有氧糖酵解水平增强,而健脾养正消癥方能够抑制荷胃癌裸鼠体内有糖糖酵解水平。7.JPYZXZF能够下调胃癌HGC-27细胞CD44+CD24+ALDH+细胞亚群比例,降低细胞体外成球能力,并下调干性相关转录因子的表达,提示JPYZXZF能够抑制胃癌细胞干性。8.PI3K/AKT/mTOR信号通路的上调能够增加胃癌细胞有氧糖酵解水平,与此同时,胃癌细胞干性也随之上升,而JPYZXZF能够挽救其提高有氧糖酵解速率这一恶性作用,同时回复对胃癌细胞干性的抑制作用;研究结论:1.晚期胃癌患者和健康人相比糖代谢模式偏向于有氧糖酵解;健脾养正消癥方治疗晚期胃癌患者,能够降低患者体内有氧糖酵解水平;2.健脾养正消癥方能诱导胃癌细胞凋亡,增加胃癌细胞化疗敏感性,其作用机制可能与下调胃癌细胞有氧糖酵解水平及干性程度相关。3.健脾养正消癥方能够通过抑制PI3K/AKT/mTOR/HIF1-α/c-Myc这一级联反应来下调下游有氧糖酵解通路关键酶表达,降低有氧糖酵解水平,从而抑制胃癌细胞干性。