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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、亚急性接触性的传染病,主要感染山羊、绵羊等小反当动物,具有极高的发病率和致死率,属于世界动物卫生组织(OIE)规定的通报性疫病。PPRV的核衣壳(N)蛋白是PPRV的主要结构蛋白,也是病毒粒子中含量最丰富且免疫原性最强的蛋白,因此被广泛应用于诊断方法的开发。为了建立一种快速、特异、敏感的PPR血清学检测方法,本研究通过对PPRVN基因进行原核表达并纯化,获得高纯度可溶性重组N蛋白,利用N蛋白作为包被抗原,建立PPR抗体检测的间接酶联免疫吸附试验(Indirect ELISA,iELISA)。根据GenBank中PPRV China/BJ/2014株(登录号KP260624)的N基因序列设计一对特异性引物,并分别在上下游引物的5’端引入NotⅠ和SalⅠ限制性内切酶的酶切位点,以人工合成的PPRVN基因质粒为模板进行PCR扩增,并将PCR产物克隆至pET-28a(+)载体上,转化E.coli DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET-28a-PPRV N。将经双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,PPRVN基因在BL21中成功表达,所表达的融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,该蛋白能被PPR抗体阳性血清所识别,具有良好的抗原性。利用Ni-NTA琼脂糖在非变性条件下对重组的PPRVN进行纯化,将纯化的N蛋白作为抗原包被酶标板,通过对抗原包被浓度、血清稀释浓度、封闭液、封闭时间、血清反应时间、二抗和底物反应时间等各项条件的优化,最终建立了检测PPR血清抗体的iELISA方法。特异性试验结果表明,建立的iELISA与布鲁氏菌病、蓝舌病和施马伦贝格病阳性血清不反应,说明该方法具有良好的特异性;将标准阳性样品稀释到1:1600时仍可检出,提示该方法具有良好的敏感性;批内、批间重复实验的变异系数均小于10%,说明该方法的重复性良好;该方法与ID-VET小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率达88%。