1生物大分子X射线晶体学结构生物学通过对生物大分子的结构和功能进行研究,解释生命的分子机制。X射线晶体学、核磁共振技术(NMR)和冷冻电镜(cryo-EM)三维重构是当今结构生物学的主要研究手段。这三种方法各有独到之处,又各有局限和不足。作为最早发展起来的结构生物学研究手段,X射线晶体学是目前解析蛋白质结构的主要手段。目前PDB(ProteinDataBank)中收录的蛋白结构中,大约有85%是利用X射线晶体学方法获得的。本章对本论文重点使用的技术手段——X射线晶体学进行以下几方面的介绍:X射线晶体学的基本原理、蛋白晶体的培养、衍射数据的收集处理、相位获取的方法原理、模型构建及修正等。对于本论文所采用的分子置换法和相关软件我们将做重点介绍。2人源Pelota的结构生物学研究Pelota在进化上是非常保守的RNA结合蛋白。在古细菌、酵母、果蝇、小鼠以及人类中,都存在Pelota蛋白。人类和小鼠的Pelota同源性高达到95%。Pelota是由三个结构域组成的,含有保守核定位信号(PRKRK)的N端结构域、与eEFl结构相似的中间结构域和C端酸性结构域。Pelota蛋白参与细胞周期的调控,影响生殖细胞的形成。它的敲除会引发不育症。Pelota也参与蛋白翻译过程的调控,保证蛋白正确地翻译。Pelota在mRNA的监控机制中和核糖体的循环利用也起到很重要的作用。Pelota是很有潜力的药物靶点,它的研究为新药开发奠定了基础。本章采用结构生物学方法人源Pelota研究进行研究。我们得到了 2.6A Pelota C端结构域/酸性尾巴的蛋白晶体,其结构与eRFl C domain结构基本上一致,但是不含minidomain,所以Pelota无法识别终止密码子和招募水解酶,所以只能参与mRNA的质量控制。这里得到的结果为Pelota相关功能和疾病研究奠定了结构基础。3 p53上调凋亡调控因子的结构生物学研究p53上调凋亡调控因子(PUMA)是BCL-2家族中BH3-only亚家族成员,是p53促凋亡途径的必需因子。PUMA可以通过p53依赖途径及非依赖途径激活Bax/Bak寡聚化,增加线粒体外膜的通透性,从而导致细胞色素C释放、促进细胞凋亡。但PUMA的作用与p53状态无关,相比p53能够更直接的促凋亡,是癌症治疗中具有很大潜力的药物靶点。Hsc70是哺乳动物细胞内的组成型表达热休克蛋白,在细胞的蛋白质代谢及调控过程中有着重要的作用。Hsc70与PUMA相互作用,可能参与PUMA蛋白折叠或者降解途径,解析PUMA或PUMA与Hsc70蛋白复合结构,有助于了解PUMA促凋亡的分子机制。本章实验尝试多种方法都没有得到PUMA蛋白晶体,我们发现PUMA的第134-165位氨基酸会形成coiled coil结构,促使蛋白多聚,所以最后尝试进行PUMA多肽与Hsc70共结晶。同时我们还鉴定了 PUMA59-177与Hsc70 ATPase相互作用,ATPase和Hsc70C△ 1OkDa的结晶实验表明,Hsc70 C△ 10 kDa蛋白极容易断裂为Hsc70 ATPase和SBDβ,在结晶过程中ATPase形成蛋白晶体,最终我们得到两种不同结合状态的ATPase结构。一个结合有ATP分子,另一个则没有,ATP结合会诱导ATPase结构域的活性部位空间变小,改变ATPase结构域的构象。我们尝试了 PUMA多肽与Hsc70 ATPase复合物的共结晶,而在解析的结构中并没有PUMA的多肽。