DNA 甲基化、组蛋白修饰和DNA 重构等，在不改变DNA原有的碱基配对特性和编码信息基础上，给DNA 增加了新的可以遗传的信息，这些修饰称之为表观遗传学修饰。DNA 甲基化在高等真核生物的发育分化、基因表达模式的时空调控以及基因组的稳定性中都起着十分关键的作用。 DNA 甲基化酶包括从头甲基化酶和和维持甲基化酶两种类型；在哺乳动物细胞中，目前已鉴定的从头甲基化酶有Dnmt 3a和Dnmt 3b，维持甲基化酶为Dnmt 1。从头甲基化酶主要向DNA上引入新的甲基化，对底物DNA 没有选择性；维持甲基化酶Dnmt1 对底物DNA 具有选择性，它优先地识别和催化一条链已被甲基化（或称之为半甲基化）的双链DNA，它的主要功能是在DNA 复制中将母链的甲基化模式忠实地拷贝到新生链上，这也正是DNA 甲基化修饰能够遗传的分子基础。从头甲基化则保证了甲基化的动态性以及对环境的适应性。大量研究表明，DNA甲基化和基因沉默紧密相关，一般情况下，基因启动子区CG 岛的甲基化导致基因表达的关闭，或称为沉默。DNA 甲基化引起基因沉默的特性提示：选择性地关闭基因的表达可以通过靶向性甲基化来实现，即将DNA 甲基化修饰特异性地引向靶基因的启动子或基因表达调节区的CG 岛。 随着近年来人造锌指蛋白设计和文库筛选技术的迅速发展，使得获得针对任何特定基因序列的定制化DNA 结合蛋白（锌指蛋白）成为现实。现已成功地使用特异性识别HSV 早期启动子IE175K VP16 结合序列的锌指蛋白引导甲基化酶对该启动子序列的高度甲基化和基因沉默，以及对COS 细胞内感染的HSV 病毒复制的显著抑制。为了提高靶向性DNA 甲基化技术的普遍适用性，我们将探讨用人造锌指蛋白引导靶向性DNA 甲基化，这也将是对锌指蛋白技术应用的一个富有创新性的拓展。为了解决上述问题，我们将构建和重组表达人造锌指蛋白引导的靶向性DNA甲基化酶，在体外分析其靶向性甲基化的特异性及效率等性能参数，为细胞内靶向性甲基化提供必要依据；然后以酵母作为模型，通过同源重组将靶基因序列定向整合入酵母基因组，观察和分析靶向性DNA 甲基化酶在酵母染色质水平对靶基因的甲基化效率以及特异性。 基于以上陈述，本实验旨在原核系统和毕赤酵母中表达纯化DNA 靶向性甲基化酶，对靶向性甲基化酶功能进行生化分析：对靶底物和非靶底物的亲和特性，甲基化酶的活性保持，对靶底物和非靶底物的DNA 甲基化效率，以及靶向性甲基化的有效范围进行分析；同时，酵母基因组不含我们使用的锌指蛋白识别和结合的序列，将锌指蛋白识别的DNA 结合序列定点引入酵母基因组中设计人造靶基因（结合位点周围序列）。通过重硫酸盐测序法分析靶向性甲基化酶在酵母染色体上的甲基化情况，为后继深入的研究工作打下基础。 本实验按如下方案展开： 1. 靶向性DNA 甲基化酶的克隆以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His 质粒为模板，进行PCR 以扩增B1-3a-Myc-6His 的DNA 片段，回收和纯化PCR 产物并将其插入到pMD 19-T 载体中进行克隆后测序分析，用BLAST 程序验证测序结果。 2. 靶向性DNA 甲基化酶B1-3a 的原核表达将测序正确的片段插入到pET32a 原核表达载体中，用IPTG 诱导表达，表达产物为包涵体。 3. 靶向性DNA 甲基化酶B1-3a 在毕赤酵母中表达以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His 质粒为模板，进行PCR 以扩增DNA，回收和纯化PCR 产物并将其插入到pPIC3.5k 酵母表达载体中进行克隆后测序分析，用BLAST 程序验证测序结果。融合表达的B1-3a-Myc-6His 蛋白仅有少量可溶性表达，绝大多数蛋白为包涵体。酵母裂解上清经Ni-NTA 偶联的琼脂糖珠纯化后，获得纯化蛋白并进行肽指纹图谱分析。 4. 将锌指蛋白识别的DNA 结合定点引入酵母基因组设计人造靶基因以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His 质粒为模板，设计3端引物，通过两次PCR 将B1-3a 的结合序列（bindingsequence，BS）连接至B1-3a-Myc-6His 下游，回收和纯化PCR 产物并将其插入到pPIC3.5k 酵母表达载体中进行克隆后测序分析，用BLAST 程序验证测序结果。通过同源重组将靶基因序列定向整合入酵母基因组。 5. 靶向性甲基化酶在酵母染色体水平的甲基化情况分析提取整合有B1-3a-Myc-6His-BS 序列的B1-3a 已诱导表达的酵母基因组，用重硫酸盐处理后的产物为模板进行PCR，回收和纯化PCR产物并将其插入到pMD 19-T 载体中进行克隆后测序分析，用BLAST 程序比对测序结果。