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花香是一个十分有价值的观赏性状,研究植物花香的合成机制对改良植物的花香性状具有十分重要的意义。在植物体中,糖是植物代谢的重要的能源物质,其含量可显著调控植物的生长和发育。己糖磷酸化是植物糖代谢的重要步骤,使己糖磷酸化的己糖激酶具有调控代谢流和作为糖信号的双重功能,但对己糖和己糖激酶基因在花香合成中的代谢调控的作用研究不多,探究己糖激酶是否通过催化己糖和作为糖传感蛋白以信号形式调控花香合成具有重要的科学意义。本研究以“西伯利亚”百合为材料,利用外源果糖和葡萄糖以及葡萄糖激酶（HXK）抑制剂N-乙酰基-葡糖胺（NAG）处理全黑暗下盛开期百合,通过GC-MS,亚细胞定位,酵母双杂,双分子荧光互补,瞬时超表达,病毒沉默和RT-qPCR等实验方法,研究己糖和己糖激酶在百合花香合成释放中的作用。主要研究结果如下:1.采用GC-MS技术测定了自然光照下‘西伯利亚’百合花瓣内源可溶性糖及昼夜节律变化。结果表明,‘西伯利亚’百合花瓣中主要含有果糖、蔗糖和葡萄糖三种可溶性糖分,且果糖和葡萄糖含量较高,均具有昼夜节律性,蔗糖含量较低昼夜节律性不明显。2.利用GC-MS技术测定了全黑暗下果糖、葡萄糖、HXK抑制剂NAG、NAG与葡萄糖混合液处理对‘西伯利亚’百合花香组成和含量变化及昼夜节律性释放。结果表明,果糖和葡萄糖均可以显著提高萜烯类花香成分罗勒烯和沉香醇的含量,NAG处理后明显抑制了萜烯类香气物质罗勒烯和沉香醇的含量,但均不影响苯甲酸乙酯的挥发量。上述处理后,不影响萜烯类花香物质罗勒烯和沉香醇释放的昼夜节律性,但苯甲酸乙酯的释放节律被打乱。3.依据‘西伯利亚’百合转录组数据,采用RT-PCR方法克隆得到两个己糖激酶的cDNA全长序列,并根据其底物亲和性分别命名为LoFRK和LoHXK。LoFRK cDNA全长996 bp,编码332个氨基酸;LoHXK cDNA全长1500 bp,编码500个氨基酸。果糖和葡萄糖处理后LoFRK,LoHXK和萜烯类合成酶LoTPS1,LoTPS3表达明显升高,而且表达趋势与花香的释放呈现一致的规律。RT-qPCR分析表明LoFRK和LoHXK两个基因在雄蕊、雌蕊、花瓣、叶和茎等八个不同组织器官均有表达,但均在雄蕊中表达量最高;随着花朵的开放,LoFRK的表达量在衰败期达到最高,LoHXK在各个时期的表达无明显差异。4.构建了LoFRK和LoHXK全长的GFP融合表达载体,通过共转细胞核marker和线粒体marker到拟南芥原生质体中表达。结果表明,LoFRK定位于胞质和细胞核,而LoHXK定位于线粒体中。5.构建LoFRK和LoHXK酵母双杂诱饵载体,利用实验室已构建好的LoMYBs和LoMYC2捕获载体,进行酵母双杂实验。结果表明LoFRK能与LoMYB1,LoMYB2互作。为进一步验证其互作,构建LoFRK双分子荧光互补C端载体和LoMYB1,LoMYB2的N端载体,LoFRK分别与LoMYB1,LoMYB2的双分子荧光互补载体通过转化农杆菌共同侵染洋葱表皮,两天后在荧光显微镜下观察,同样能看到绿色荧光,DAPI染色后,在细胞核中观察到蓝色荧光,进一步验证了LoFRK能与LoMYB1,LoMYB2在细胞核里互作。6.构建LoFRK和LoHXK的病毒沉默载体,利用农杆菌侵染‘西伯利亚‘百合花瓣。结果显示,瞬时沉默LoFRK和LoHXK后,罗勒烯分别降低了60%和43%,沉香醇分别降低了52%和33%,而苯甲酸乙酯的含量均无明显变化;定量表达分析发现,LoFRK降低了61%,LoHXK降低了58%,LoTPS1表达量分别降低了70%和80%,LoTPS3表达量分别降低了79%和87%,LoMYB1表达量分别降低了35%和75%,LoMYB2表达量分别降低了78%和39%。7.采用GC-MS分析测定了‘西伯利亚’百合在全黑暗下非放射性同位素13C标记的果糖和葡萄糖处理后主要花香成分离子质谱图的变化。结果显示,同位素标记后,果糖和葡萄糖处理后测得的罗勒烯和沉香醇的离子质谱图均有明显变化,m/z均有升高,而苯甲酸乙酯无明显变化,说明外源果糖和葡萄糖作为底物参与萜烯类花香成分沉香醇和罗勒烯的合成,不参与苯丙烷类挥发性物质苯甲酸乙酯的合成。8.构建LoFRK和LoHXK的酶催化位点点突变和未突变的过表达载体,利用农杆菌侵染‘西伯利亚’百合花瓣进行超表达。结果表明,与空载相比,突变酶催化位点和超表达LoFRK后,罗勒烯和沉香醇分别升高了65%和79%,但比未突变酶催化位点的超表达LoFRK后罗勒烯和沉香醇分别低77%和64%;突变酶催化位点和过表达LoHXK后,罗勒烯和沉香醇含量比空载对照升高了30%和74%,但比未突变酶催化位点的超表达LoHXK后罗勒烯和沉香醇分别低91%和50%,而苯甲酸乙酯的含量仍无明显变化。定量表达分析表明,突变催化位点和未突变的过表达LoFRK及LoHXK后,LoFRK表达量分别升高75%和98%,LoHXK表达量分别升高67%和112%,LoTPS1分别升高43%、99%、24%和56%,LoTPS3分别上调25%、86%、21%和66%,LoMYB1分别升高65%、103%、23%和30%,LoMYB2表达量分别升高99%、12%、30%和83%,说明LoFRK和LoHXK在百合萜类花香物质沉香醇和罗勒烯形成过程中既具有酶催化功能,同时还可能具有糖传感蛋白的作用。