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目的维生素D属于脂溶性维生素,不仅影响骨骼的生长和重塑,而且在糖尿病、代谢综合征、癌症及自身免疫性疾病等方面也发挥潜在的作用。维生素D缺乏已经成为全世界共同关注的健康问题。目前,25-羟维生素D是评估维生素D营养状态的首选生物标志物。但近期研究发现,血清Free-250HD作为评估维生素D营养状态的生物标志物可能较血清T-25OHD更有意义。到目前为止,血清Free-25OHD的检测方法有2种:直接法(ELISA)和间接法(计算法)。两种检测方法各有优缺点,且一致性较差。因此,亟需寻找一种可靠的方法检测血清Free-25OHD。本研究的目的:第一部分:建立血清Free-25OHD液相色谱串联质谱的检测方法并评估其性能,评价多种血清Free-25OHD检测方法(LC-MS/MS法、ELISA法、计算法)的一致性。第二部分:血清Free-25OHD液相色谱串联质谱检测方法的临床应用。第三部分:性别、年龄及季节对血清T-25OHD的影响。方法第一部分:采用超滤法分离血清、液液萃取提取Free-25OHD,经衍生后,进行LC-MS/MS分析。参考CLSI相关文件,对该方法的精密度、灵敏度、正确度、线性、携带污染、基质效应、方法学比对进行验证。第二部分:(1)收集健康体检中心2019年4月到11月进行体检的120名表观健康人的临床检测剩余血清样本,用于评估血清Free-25OHD的分布情况;(2)收集健康体检中心2018年11月到2019年2月进行体检的312名表观健康老年人的临床检测剩余血清样本。评估老年人群Free-25OHD分布情况,及其与维生素D代谢产物、常见生化指标的相关性;(3)收集健康体检中心2019年4月到11月表观健康人临床检测的剩余血清样本65份,用于Free-25OHD与骨密度相关性的研究。所有入组个体,根据骨密度检测结果分为两组:T值>1代表骨密度正常(n=27),T值<-1代表骨质流失(n=38);(4)收集健康体检中心2018年11月到2019年2月进行体检的临床检测剩余血清样本,对照组62例,糖尿病前期67例。第三部分:收集2015年12月到2018年10月的临床T-25OHD检测结果及基本信息,评估性别、年龄及季节对血清T-25OHD浓度的影响。结果第一部分:血清Free-25OHD LC-MS/MS检测方法的重复性为6.0%—9.3%,实验室内不精密度为11.9%—17.7%,该方法的检测限和定量限分别为1.9pg/mL、3.9pg/mL,基质效应为93.2%-105.4%。方法学比对的样本中T-25OHD及3种方法检测Free-OHD(LC-MS/MS方法、ELISA方法及计算方法)的浓度分别为 20.0±9.3 ng/mL、3.88± 2.14 pg/mL、3.10±1.10 pg/mL 及4.48±2.25 pg/mL。Passing-Babloke方程显示R2为0.62-0.72。Bland-Altman显示三种方法的平均偏差为-0.8 pg/mL—1.4 pg/mL。第二部分:(1)人群血清Free-25OHD的分布(中位数,P2.5—P97.5)为4.25(1.97—9.03)pg/mL,男、女性血清Free-25OHD的中位数分别为4.26 pg/mL、4.25 pg/mL(P=0.8519)。(2)老年人群血清 Free-25OHD 的分布(中位数,P2.5—P97.5)为 2.65(1.10—5.53)pg/mL。T-25OHD 与 25OHD3、1,25(OH)2D、24,25(OH)2D 及 Free-25OHD 均呈正相关,而与25OHD/24,25(OH)2D呈负相关。(3)骨密度正常组血清Free-25OHD水平高于骨质流失组,但差异无统计学意义(P=0.1690)。按照不同骨密度分类,血清Free-25OHD 的均值分别为 3.42 pg/mL(T<-2)、4.59 pg/mL(-2≤T<-1)、4.35pg/mL(-1≤T≤0)、4.96 pg/mL(0≤T≤2)、7.75 pg/mL(T≥2)。(4)糖尿病前期组血清Free-25OHD显著高于对照组,且差异有统计学意义(P=0.3868)。血清T-25OHD在糖尿病前期组和对照组的分布无显著性的差异(P=0.1300)。第三部分:男性血清T-25OHD水平明显高于女性(P<0.001)。按照年龄分组,血清T-25OHD中位数在19-29岁年龄组最低,而0-10岁年龄组最高。春、夏、秋、冬季的血清T-25OHD浓度的中位数分别为15.3 ng/mL、20.5 ng/mL、19.8 ng/mL和14.4 ng/mL。按照月份分组,血清T-25OHD 3月最低,8月最高,最高值和最低值相差61.1%。结论第一部分:本研究建立了血清Free-25OHD LC-MS/MS的检测方法,且基本性能良好。LC-MS/MS法与计算法检测血清Free-25OHD的一致性较好。第二部分:(1)血清 Free-25OHD 的分布为 4.25(1.97-9.03)pg/mL。(2)老年人血清Free-25OHD水平随着T-25OHD的增高而升高。(3)Free-25OHD与骨密度存在一定的关系。(4)在糖尿病前期,血清Free-25OHD作为评估维生素D营养状态指标可能优于T-25OHD。第三部分:性别、年龄及季节影响血清T-25OHD浓度,其中季节影响最大。