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本文对纤溶酶原激活物抑制因子1的抑制剂设计及其结构机理进行了研究。本研究分为两个部分： 第一部分：基于机理的新型PAI-1抑制剂的设计。纤溶系统包含:两个激活酶，组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶(uPA);两种特异性的抑制剂，纤溶酶原激活物抑制剂因子1(PAI-1)和2-型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-2);尿激酶特异性受体(uPAR)和纤溶酶原（plasminogen）（图1-1）。纤溶系统调控着许多重要的生理过程如纤维蛋白溶解(fibrinolysis)、细胞的粘附、侵染和转移等。PAI-1是tPA在体内的天然抑制剂，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族的重要成员。在体内，PAI-1是纤溶系统的重要负性调控因子，PAI-1水平的异常升高会使溶血系统失调导致血栓形成。因此PAI-1被认为是抗血栓性疾病的重要药物作用靶标。此外，PAI-1还通过介导血管新生（angiogenesis）、细胞增殖以及竞争结合玻连蛋白(vitronectin)等生理过程参与肿瘤的转移和粘附。因此PAI-1还是一个重要的抗肿瘤药物作用靶标。目前PAI-1已经被美国临床肿瘤学会(ASCO)确定为乳腺癌检测的首选标志物。由此，关于PAI-1抑制剂发现与设计的研究具有十分重要的意义和应用前景。基于本课题组先前解析的PAI-1·uPA米氏复合物晶体结构，结合PAI-1的“底物自杀性抑制机制”（图2-1），我们设计了一种全新的蛋白类PAI-1抑制剂（PAItrap）(图2-8)。PAItrap是uPA的一种失活突变体，它通过与PAI-1结合形成稳定的米氏复合物而阻止PAI-1对活性u/tPA的抑制作用。PAItrap对PAI-1具有强抑制作用(IC50=10nM); PAItrap对结构上与PAI-1类似的其它Serpin蛋白，如PAI-2、PN-1、antithrombin-3和α2-antiplasmin的抑制能力相对很弱(IC50≥14μM)，说明PAItrap对PAI-1的抑制具有高度选择性;表面等离子共振技术(SPR)显示，PAItrap与PAI-1的直接结合常数Kd值为0.15 nM;在血浆水平上，我们通过血块溶解实验(clot lysis assay)证实，PAItrap具有良好的抗血栓效果;PAItrap对于鼠源PAI-1也具有相当强的抑制效果(IC50=14nM)，便于在小鼠体内对其进行评价;我们在小鼠水平上确证了PAItrap的抗血栓效果，并研究了其在体内的抗血栓机理。本研究开发了一种全新的以PAI-1为靶标的蛋白类抗血栓性疾病的药物。此外，该药物的设计思路也可用于设计其他蛋白类药物。tPA是纤溶系统中的一种关键酶，其唯一的生理特异性底物是纤溶酶原(plasminogen)。tPA通过激活纤溶酶原形成具有活性的纤溶酶(plasmin)，进而行使溶栓功能。重组tPA(rtPA，或其突变体)是经FDA批准的一种溶栓药物。然而其在血浆内半衰期只有几分钟，这就要求临床上使用高剂量的rtPA;高剂量的注入具有酶活的rtPA又会导致病人颅内出血等致命性副作用。PAI-1是体内tPA的特异性抑制剂，能够快速抑制tPA(2.6×107 M-1s-1)。许多研究人员都试图通过对tPA的突变来增强tPA对PAI-1抑制的抵抗，进而降低rtPA药物的临床使用剂量，减少副作用的发生。尽管研究人员在此方面作了大量的生化功能研究，但目前仍缺乏二者相互作用的结构基础，究其原因主要是由于活性态PAI-1的不稳定而且易聚集导致对PAI-1的结晶异常困难。这就使得对tPA的定点改造有一定的盲目性。 第二部分，利用X-射线晶体学技术，综合运用了定点突变和生物物理方法克服了PAI-1的不稳定及易聚集的问题并成功地获得了PAI-1·tPA-S195A的复合物晶体，解析了该复合物的结构。结构解析表明，由于与tPA的相互作用，PAI-1使用一个柔顺性较强的活性中心环(RCL)插入tPA催化口袋，从而能快速并特异地识别tPA。tPA活性中心外部的表面loop，如37-loop,60-loop，96-loop，147-1oop和169-loop对tPA与PAI-1的相互结合同样非常重要。此外，与PAI-1结合过后，tPA的S2和S1β口袋采取了开放构象并结合了PAI-1的相应基团。本研究从原子水平上揭示了PAI-1和tPA相互作用的结构机理，为设计新型的抗PAI-1抑制的rtPA作为溶栓剂提供了结构基础。并且经比较发现，PAI-1·tPA-S195A的复合物晶体结构与PAI-1·uPA-S195A结构具有显著差别。