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【研究背景】乳腺癌居女性恶性肿瘤发病率的首位。乳腺癌的发生发展与雌激素水平密切相关。约70%的乳腺癌是雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)阳性乳腺癌;在这些患者中,ERα信号通路尤为重要,经雌激素活化的ERα发生二聚化进入细胞核,并结合到大量增殖相关靶基因的雌激素反应元件(estrogen response elements,ERE)上,调控靶基因转录从而促进乳腺癌细胞的异常增殖。由于ERα是ERα阳性乳腺癌细胞生长的主要驱动因子,因此以ERα为靶点的内分泌治疗被广泛应用,其中的代表药物为他莫昔芬。虽然内分泌治疗能够挽救部分患者的生命,但仍有30%-40%的患者会出现转移性复发。有临床流行病学发现,部分ERα阳性患者接受他莫昔芬治疗后,出现ERα阴性转移灶的几率显著增高;还有报道显示:在侵袭性乳腺癌中ERα表达显著降低。这些研究提示:ERα可能对乳腺癌转移具有抑制作用,然而目前关于ERα表达与乳腺癌转移的关系尚不明确。【研究目的】本研究拟通过对乳腺癌临床样本分析以及体外细胞学、体内动物实验,系统阐明ERα与乳腺癌转移的关系及其相关分子机制,完善ERα在乳腺癌发生发展中的功能,为乳腺癌侵袭转移提供新机理,也为发掘潜在的乳腺癌转移治疗靶点提供理论基础。【方法】1.收集ERα阳性的乳腺癌原发灶标本以及配对的淋巴结转移灶标本,通过免疫组化检测ERα在其中的表达情况;2.瞬时转染ERα质粒/si RNA,利用transwell实验体外观察ERα对乳腺癌细胞侵袭能力的影响;利用慢病毒构建稳转ERα或ERα敲除的乳腺癌细胞系,结合裸鼠肿瘤转移模型以及小动物活体成像仪体内观察ERα对乳腺癌细胞转移的影响;3.构建3D细胞培养体系,利用激光全息仪动态观察对照细胞以及ERα敲除细胞的运动方式;利用激光共聚焦观察对照细胞以及ERα敲除细胞中F-actin、p MLC表达及分布;4.收取ERα过表达细胞以及对照细胞进行转录组测序,筛选目的分子;5.在乳腺癌细胞内,瞬时转染ERα质粒/si RNA,利用q PCR(quantitative real-time PCR)、WB(western blotting)、细胞免疫荧光实验,观察ERα对vinculin表达的影响;6.应用Ch IP(chromatin immunoprecipitation)、报告基因实验,进一步明确ERα调控vinculin表达的机制;7.利用CRISPR/Cas9系统构建vinculin敲除细胞系,结合裸鼠尾静脉注射实验,体内观察vinculin对乳腺癌细胞转移的影响;8.采用激光共聚焦、激光全息仪,观察vinculin对细胞阿米巴样运动的调节作用;采用裸鼠乳腺脂肪垫注射以及肺部外渗实验,探讨vinculin能否通过调节细胞阿米巴样运动,进而参与乳腺癌细胞在体转移;9.在ERα过表达细胞中,构建vinculin干涉以及对照细胞,结合裸鼠乳腺脂肪垫注射模型以及transwell实验,探讨vinculin是否参与ERα介导的抑制乳腺癌转移;10.通过免疫组化实验,观察ERα与vinculin在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌转移的关系。【结果】1.ERα在乳腺癌淋巴结转移灶的表达显著降低;进一步分析发现ERα在乳腺癌侵袭前沿表达也显著降低;2.当在乳腺癌细胞中过表达ERα时,细胞的侵袭转移能力显著降低;相反地,在乳腺癌细胞中干涉ERα时,细胞的侵袭转移能力显著提高;3.在3D基质胶中,ERα敲除促进了MCF-7细胞侵袭能力,更重要的是,这一过程不受基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMP)抑制剂影响;ERα敲除诱导MCF-7细胞阿米巴样运动,表现为:阿米巴样突起形成增多,p-MLC表达增高并在细胞尾部极化,细胞变圆;4.通过转录组测序,发现与细胞运动相关基因富集,进一步验证发现,粘着斑蛋白vinculin变化最显著;5.在ERα阳性乳腺癌细胞内,干涉ERα表达,导致vinculin表达显著降低;在ERα阴性乳腺癌细胞内,过表达ERα,导致vinculin表达显著增高;6.ERα通过直接与vinculin启动子上ERE序列结合,促进vinculin转录活性;7.Vinculin敲除促进乳腺癌细胞肺转移;8.在3D基质胶中,vinculin敲除导致细胞阿米巴样突起形成增多、p-MLC表达增高并在细胞尾部极化、细胞变圆;进一步结合体内实验,发现vinculin能够通过抑制细胞阿米巴样运动,抑制乳腺癌转移;9.通过transwell实验以及裸鼠乳腺脂肪垫注射模型发现,vinculin参与ERα介导的抑制乳腺癌转移;10.经过临床样本相关性分析,发现在乳腺癌转移灶以及淋巴结转移灶中,ERα的表达与vinculin表达呈正相关,且vinculin的表达与乳腺癌转移呈负相关。【结论】1.本研究通过乳腺癌临床样本分析以及细胞、动物水平的实验,证实ERα能够抑制乳腺癌转移;2.ERα表达缺失促进乳腺癌细胞阿米巴样运动;3.发现在乳腺癌细胞中,ERα能够通过与vinculin启动子结合,调节vinculin转录活性,进而促进vinculin表达;4.发现vinculin表达缺失促进乳腺癌转移,且vinculin能够通过调节细胞阿米巴样运动,抑制乳腺癌转移;5.通过乳腺癌临床样本分析以及细胞、动物水平的实验,证实ERα通过促进vinculin表达从而抑制乳腺癌的转移。