胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,约占消化系统肿瘤的3%。根据解剖位置可将其分为肝内胆管癌和肝外胆管癌,我国主要以肝内胆管癌为主。由于肝内胆管癌早期发病无明显症状,且缺乏有效的早期筛查手段,患者一经确诊往往已为中晚期。目前治疗肝内胆管癌最有效的方法是手术切除,但对于中晚期患者而言切除后复发率高,预后差。因此,肝内胆管癌的早发现对提高患者生存率尤为重要。众多研究表明,抑癌基因的异常甲基化与肿瘤的发生发展密切相关,该现象通常发生于癌变之前或癌症早期,具有作为肿瘤早期诊断和预后检测的生物标志物的潜力。本论文主要评估了甲基化生物标志物组合对肝内胆管癌的诊断能力,并探索了 BARHL2基因在肝内胆管癌发生发展中的作用及分子机制,以期寻找肝内胆管癌潜在的早期诊断标志物并为揭示肝内胆管癌发生机制奠定基础。我们首先对TCGA数据库中胆管癌相关的Illumina450K甲基化芯片数据进行分析,初步筛选到一些在胆管癌组织中甲基化程度高于癌旁组织的候选基因,对这些候选基因的实验可操作性进行评估并查阅相关文献,最终选择了 AHRR、ARRB2、BARHL2和FGF8四个在肝内胆管癌中未进行甲基化研究的基因。通过目的区域甲基化MethylTarget检测技术,以LINE-1基因做为阳性对照,RBMY1F基因做为质控对照,在104对肝内胆管癌及癌旁组织中对候选基因甲基化状态进行验证。结果表明,阳性对照基因LINE-1在肝内胆管癌组织中的甲基化水平显著低于癌旁组织（p=1.2×10-4）;质控对照基因RBMY1F的甲基化程度在肝内胆管癌和癌旁组织中无显著性差异（p＞0.05）,说明测序结果可靠。接下来对候选基因甲基化水平进行验证,结果显示这四个候选基因在肝内胆管癌组织的甲基化水平均高于癌旁组织,其中,ARRB2和BARHL2基因的甲基化差异较为显著。之后通过logistic回归分析评估了单基因以及四个基因组合的甲基化状态对肝内胆管癌的诊断价值。结果表明,相较于单基因,多基因组合用于诊断肝内胆管癌的敏感度和AUC值均有所提高,提示多基因甲基化组合模型可能有着更高的诊断价值。在这四个基因中,我们关注到BARHL2基因在肝内胆管癌和癌旁组织中的甲基化水平差异最为显著,该基因在肝内胆管癌中未见报道。为探讨BARHL2基因的异常甲基化对肝内胆管癌发生产生的影响,我们首先通过组织芯片免疫组化检测了肝内胆管癌和癌旁组织中BARHL2蛋白的表达水平并分析了其与临床参数的关系,发现该蛋白在肝内胆管癌组织中低表达（p＜0.001）且与癌细胞转移相关（p=0.0334）。随后,检测了 29对肝内胆管癌及癌旁组织中BARHL2基因的甲基化水平以及mRNA的表达,发现与癌旁组织相比,BARHL2基因在肝内胆管癌中呈现高甲基化且mRNA表达下调。我们进一步通过实验对其进行了验证,结果发现,经5-Aza去甲基化处理后的细胞BARHL2表达上调,对BARHL2启动子过甲基化处理后荧光素酶活性下降,证实BARHL2基因受甲基化修饰的调控,该基因高甲基化会导致其低表达。为探究BARHL2表达量的变化是否会影响肝内胆管癌细胞的生物学效应,我们在肝内胆管癌细胞中过表达BARHL2基因,发现BARHL2基因的过表达可抑制肝内胆管癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力,表明BARHL2基因在肝内胆管癌中发挥肿瘤抑制因子作用。该基因在肝内胆管癌中的作用机制尚未见报道,经初步探索发现,肝内胆管癌细胞中BARHL2基因过表达会导致β-catenin蛋白表达量降低,同时qRT-PCR检测结果分析显示,BARHL2基因过表达后,β-catenin、c-Myc和cyclinD1的转录水平下降。提示BARHL2基因可能通过下调β-catenin的表达参与Wnt/β-catenin信号通路,进而使其下游肿瘤相关分子如c-Myc和cyclinD1的表达下降,抑制肿瘤的发生。鉴于BARHL2是一个转录因子,后续对其辅调控蛋白及下游靶基因的进一步探究将有助于我们深入了解该基因在肝内胆管癌中的作用机制,为肝内胆管癌的临床治疗提供一定的思路和数据。