动物中的研究表明,血红素加氧酶(heme oxygenase,HO,EC1.14.99.3)是一种重要的信号系统,可以降解血红素,最终生成胆绿素(BV)、一氧化碳(CO)和亚铁离子(Fe2+)。最近研究发现,植物HO不仅具有氧化防护作用,还参与植物侧根、不定根发生和光敏色素合成等。本研究以油菜为材料,克隆了油菜血红素加氧酶-1基因(BnHO-1),进行融合蛋白的原核表达；利用生物信息学手段推测蛋白BnHO-1序列,并进行结构和功能的分析；进一步地在此基础上,对BnHO-1在侧根发生中的作用进行了初步的探索。结果如下：用已克隆的拟南芥AtHO-1基因(AB021858)序列在NCBI(?)由菜表达序列标签库(EST)中搜索,所得序列导入Vector NTI软件后进行多次拼接比对,得到一条推测为BnHO-1的核苷酸序列。根据其开放阅读框(ORF)序列设计引物,通过RT-PCR的方法扩增得到目的片段,将目的片段克隆入pMD19-T载体中测序验证。生物信息学分析显示,BnHO-1ORF序列长为843bp,编码一条含282个氨基酸残基的蛋白质序列。Blastx分析显示,其编码的氨基酸序列与其他植物物种的同源性较高,其中与拟南芥的同源性最高,为84.6%。Compute pI/Mw tool预测,该序列编码的蛋白质理论等电点为8.13,理论分子量为32.6kD。PSIPRED软件分析,目的蛋白二级结构主要由a-螺旋(占70.2%)和无规则卷曲(28.5%)构成,p-折叠仅占1.3%。SignalIP信号肽分析显示,该序列具有信号肽序列,最可能的剪切位点位于编码区第54和55号氨基酸残基之间。根据目的基因去除编码信号肽序列的核苷酸及表达载体pET30a序列设计引物,PCR扩增获得目的片段,将纯化后的目的片段定向插入到pET30a载体中。重组质粒转入大肠杆菌菌株BL21,在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析显示,在30.7kD左右出现差异性条带,与理论计算值大致相符。融合蛋白经通过亲和层析法纯化后,融合蛋白纯度达95%,并与抗水稻HO-1的抗体杂交呈Western特异性条带。纯化后融合蛋白与氯化血红素(hemin)反应的时间进程曲线显示,随反应的进行,体系在405nm处(血红素蛋白)吸光值逐渐降低,650nm处(BV)的吸光值逐渐上升,表明融合蛋白具有HO活性。酶学分析表明,融合蛋白反应最适温度为25℃,最适pH为7.2。酶反应动力学参数Vmax为4.93U·mg-1protein,Km值为2.99μM hemin。本文还初步探查了BnHO-1在侧根发生中作用。首先,检测BnHO-1在油菜幼苗中的组织特异性分布,发现在油菜根、茎、叶和花中都有表达,其中根部表达量最高。已报道的侧根诱导物hemin、NAA、H2O2和SNP均能明显诱导油菜侧根的发生；且处理3、6和12h BnHO-1的转录本有不同程度地上调。研究发现,NaCl和PEG不仅以浓度依赖方式促进油菜侧根的发生,而且能促进根部生长素(IAA)的积累和极性分布。加入IAA专一性运输阻断剂NPA预处理,则消除NaCl和PEG对油菜侧根发生、IAA积累和极性分布的影响。本文进一步研究HO是否参与NaCl和PEG诱导侧根发生的过程。发现NaCl和PEG可以诱导根部HO的转录水平、蛋白表达及活性；HO专一性抑制剂ZnPP预处理可以抑制低浓度NaCl和PEG对侧根发生及HO表达的诱导作用；而HO-1诱导剂hemin则可以部分消除ZnPP的抑制作用。以上结果表明HO可能参与了NaCl和PEG对油菜侧根发生的诱导。本文进一步研究NaCl和PEG诱导HO表达的机理,发现NPA预处理阻断了NaCl和PEG对HO的转录水平、蛋白表达及活性的诱导,推测内源IAA可能参与NaCl和PEG对HO的调节,从而影响侧根的发生。