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目的:脊髓损伤(SCI)致残给患者及其家庭带来极大痛苦和巨大的经济负担,因此寻找有效治疗SCI的策略,已成为当前亟待解决的社会问题。脊髓下行固有神经元(DPSN)在自发运动和随意运动的产生和调控中发挥重要的作用,SCI后皮质脊髓束(CST)可通过轴突发芽重新连接支配DPSN轴突,DPSN轴突可塑性改变能够促进其通过和跨越病变部位,使中枢指令通过DPSN轴突功能性介导,有效传递到病变部位以下的脊髓结构中,这提供了一个神经传导的替代途径即“功能性中继”的作用,促进脊髓功能的重建。目前DPSN轴突可塑性是脊髓损伤后功能重建的重要治疗靶点。核转录因子KLF7在神经系统中广泛存在,近年研究表明KLF7对中枢神经系统轴突再生、神经胶质细胞分化和髓鞘形成都发挥重要作用。敲除KLF7基因可导致中枢神经、视网膜和嗅觉神经损伤后轴突再生障碍,KLF7高表达能够促进脊髓损伤后CST轴突再生。本课题组前期研究发现:①AAV-KLF7病毒联合脱细胞神经支架桥接坐骨神经神经缺损,有效促进周围神经再生。②KLF7能够促进周围神经损伤后感觉和运动轴突再生、髓鞘形成和功能恢复。③KLF7转染施万细胞(SCs)后,促进SCs增殖。但KLF7对脊髓损伤后DPSN轴突可塑性作用及机制研究尚未见报道。本项目拟以DPSN轴突再生、突触生成、髓鞘形成及功能恢复等为切入点,探讨KLF7体外对脊髓神经元突起及脊髓背根节(DRG)神经元轴突再生的作用机制;阐明KLF7体内调控SCI损伤后DPSN轴突可塑性及功能重建的作用及其机制,为临床脊髓损伤治疗提供新的治疗策略和靶点。研究方法:一、体外实验:1、脊髓神经元分离培养,应用AAV-GFP病毒转染脊髓神经元,检测AAV病毒转染率。应用AAV-KLF7、AAV-NC腺相关病毒转染脊髓神经元,将实验细胞分为AAV-KLF7组、AAV-NC组、Control组;2、免疫荧光染色检测各组脊髓神经元KLF7表达及脊髓神经元突起形态特征;3、Westernblot和PCR检测各组脊髓神经元细胞KLF7及靶点NGF、TrkA蛋白和mRNA的表达;4、IncuCyte ZOOM实时分析AAV-KLF7对脊髓神经元突起生长的作用;5、DRG神经元培养,免疫荧光染色和Sholl分析检测AAV-KLF7及AAV-NC病毒转染的DRG神经元轴突再生情况。二、体内实验:1、应用路易斯维尔损伤系统仪器(LISA)制备小鼠脊髓T10节段Contusion损伤模型;2、Westernblot检测SCI术前及术后1d、lw、2w、3w、4w脊髓损伤灶KLF7表达动态变化;3、在小鼠脊髓T7-9节段间注射AAV-NC和AAV-KLF7,实验动物分为SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组、Sham组;4、Westernblot检测KLF7、NGF、TrkA、GAP43和P0蛋白表达;5、甲酚紫伊红染色、Luxol Fast Blue法及Neurolucida系统检测SCI后5w各组小鼠损伤灶面积、体积及髓鞘保留情况;6、荧光金(FG)逆行示踪DPSN结合免疫荧光标记AAV-KLF7转染DPSN,验证AAV-KLF7是否有效转染T7-9节段DPSN;7、T7-8节段生物素葡聚糖胺(BDA)注射顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色检测损伤灶T10节段GFAP(标记星形胶质细胞)和BDA,检测KLF7对损伤灶DPSN轴突可塑性作用;8、霍乱毒素B(CTB)坐骨神经注射逆行示踪标记腰段运动神经元胞体和树突,BDA顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色检测突触素(SYP),激光共聚焦和免疫荧光三标检测L4-5节段DPSN轴突与运动神经元突触形成情况;9、电子显微镜检测损伤灶周围轴突髓鞘形成情况;10、免疫荧光染色标记T7-9节段KLF7和CC1(标记少突胶质细胞)、NG2(标记少突胶质前体细胞)、GFAP(标记星形胶质细胞),明确KLF7在各细胞内表达。三、功能重建检测:1、患侧胫骨前肌(TA)湿重及Roots-Karnovsky染色计数运动终板密度;2、BMS评分检测;3、Grid walking检测;4、电生理检测;5、Hargreaves检测结果:1、免疫荧光染色检测AAV-GFP转染脊髓神经元的转染率为84.70±5.57%。与AAV-NC组比较,AAV-KLF7组KLF7蛋白表达显著增高(P<0.001)。同时发现AAV-KLF7组神经元突起平均长度较AAV-NC组显著增高(P<0.001)。2、Western blot和PCR检测结果表明:与AAV-NC组和Control组比较,AAV-KLF7组KLF7蛋白及其mRNA表达均显著增高(P<0.05);而且AAV-KLF7组NGF、TrkA蛋白及其mRNA表达亦显著高于AAV-NC组和Control组(P<0.05),但KLF7、NGF、TrkA蛋白和mRNA表达在AAV-NC组与Control组之间无显著差异(P>0.05)。3、IncuCyte ZOOM系统检测结果表明:相比于AAV-NC组,AAV-KLF7组神经元突起长度和突起分支数量在病毒转染后3d和4d均显著增加(P<0.05)。4、Sholl分析结果表明AAV-KLF7组DRG神经元轴突平均长度显著高于AAV-NC 组,AAV-KLF7 组在 0-60°、180-240°、240-300°及 300-360°角度 DRG 神经元轴突总长度亦显著高于AAV-NC组(P<0.001)。5、Western blot结果显示:脊髓胸段组织基线水平KLF7蛋白表达较低。SCI后1 d损伤灶中KLF7蛋白表达增高,KLF7表达峰值出现在SCI后1-2 w,在SCI后3-4w恢复到基线水平(P<0.00l)。6、Western blot检测结果显示:与Sham组和SCI+AAV-NC组损伤灶组织KLF7蛋白仅少量表达相比,SCI+AAV-KLF7组KLF7蛋白表达显著增加(P<0.001)。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组损伤灶组织NGF、TrkA和GAP43蛋白表达增高,其中SCI+AAV-KLF7组NGF、TrkA和GAP43蛋白表达显著高于SCI+AAV-NC组(P<005)。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组P0蛋白表达显著降低,其中SCI+AAV-KLF7组P0蛋白表达显著高于SCI+AAV-NC 组(P<0.05)。7、甲酚紫伊红染色、Luxol Fast Blue及Neurolucida系统检测结果显示:SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组脊髓损伤灶面积百分比和体积百分比无显著差异(>0.05),但SCI+AAV-KLF7组残余髓鞘百分比显著高于SCI+AAV-NC组(P<0.05)。8、FG逆行示踪DPSN和免疫荧光染色结果显示:SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组T7-9节段FG逆行标记细胞数量无显著差异(P>0.05),但SCI+AAV-KLF7组KLF7蛋白表达和FG/KLF7共标神经元百分比显著高于SCI+AAV-NC 组(P<0.05)。9、BDA顺向示踪DPSN轴突和免疫荧光染色结果显示:在T10损伤灶节段,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组GFAP蛋白表达无显著差异(P>0.05),但SCI+AAV-KLF7组BDA蛋白表达显著高于SCI+AAV-NC组(P<0.05)。10、CTB逆行标记腰段运动神经元胞体和树突,BDA顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色结果显示:在L4-5节段,SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组和Sham组CTB逆行标记脊髓前角运动神经元数量无显著差异(P>0.05)。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组BDA相对密度和SYP相对密度/运动神经元显著降低,其中SCI+AAV-KLF7组BDA相对密度和SYP相对密度/运动神经元显著高于SCI+AAV-NC组(P<0.05)。11、电镜结果显示:Sham组T10节段轴突有髓鞘比率显著高于SCI+AAV-KLF7和 SCI+AAV-NC组;SCI+AAV-KLF7组损伤灶周围轴突髓鞘比率显著高于SCI+AAV-NC 组(P<0.001)。12、免疫荧光染色结果显示:在T7-9节段,多数NG2阳性细胞表达KLF7,NG2/KLF7共标神经元百分比为84.22±6.95%。仅少数CC1阳性细胞表达KLF7,CC1/KLF7共标神经元百分比为10.23±2.39%,未发现有GFAP阳性细胞表达KLF7。13、SCI 后 5w,与 Sham 组比较,SCI+AAV-KLF7 组和SCI+AAV-NC 组 TA湿重显著降低,TA湿重在SCI+AAV-KLF7和SCI+AAV-NC组之间无显著性差异(P>0.05)。此外,运动终板染色显示SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组和Sham组三组运动终板数量/肌纤维无显著差异(P>0.05)。14、行为学检测结果:①BMS评分结果表明:SCI后5w,SCI+AAV-KLF7组BMS评分显著高于SCI+AAV-NC组(P<0.05);②Grid walking检测结果表明:SCI+AAV-KLF7组网格行走错误数显著低于SCI+AAV-NC组(P<0.05);③电生理结果显示:与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组波幅显著降低,潜伏期显著延长,其中SCI+AAV-KLF7组较SCI+AAV-NC组波幅显著增高,而潜伏期显著缩短(P<0.05);④Hargreaves检测结果显示:与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组热缩足反射潜伏期显著增高,而SCI+AAV-KLF7组反射潜伏期与SCI+AAV-NC组无显著性差异(P>0.05)。结论:1、AAV-KLF7能够有效转染脊髓和DRG神经元,增加脊髓神经元KLF7、NGF、TrkA的表达,进而促进脊髓神经元神经突和DRG轴突生长。2、KLF7通过上调靶基因NGF、TrkA、GAP43的表达,促进DPSN轴突可塑性及与腰段运动神经元突触形成。3、KLF7能使SCI后降低的P0上调,且在少突胶质前体细胞表达,促进损伤灶周围髓鞘形成。4、AAV-KLF7促进SCI后运动功能恢复。