背景和目的：　　近年来随着对抑郁症研究的不断深入，其发病机制已经不再仅局限于单纯的神经递质失调学说。抑郁症患者在服用抗抑郁药物之后，不但神经突触间隙间5-羟色胺（5-serotonin,5-HT）、多巴胺(dopamine，DA）及去甲肾上腺素（noradrenalin，NA）浓度会升高，而且病人体内的炎症前细胞因子（Proinflammatorycytokines）水平也会较发病期间明显降低。国内外大量的体内及体外研究发现炎症前细胞因子，诸如IL-1β、IL-6、NO及TNF-α等能够通过影响神经胶质细胞的活化及神经发生、海马区神经元的损伤及再生修复及神经营养性类因子，如脑源性神经营养因子（Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）等的生成直接或者间接的导致抑郁症的发生。神经胶质细胞是中枢神经系统中脑细胞的重要组成部分，它们不但起到支持、营养神经元的功能，而且能够分泌上述的多种炎症前细胞因子，这些细胞因子分布及作用广泛，并通过特殊的途径与神、免疫、内分泌系统相互作用组成神经-免疫-内分泌系统，在应对应激、炎症反应等过程中起到重要作用，而应激及炎症反应过程可能参与到抑郁症的发病机制中。因此一些学者认为炎症前细胞因子在抑郁症的发病机制中起到了重要作用。　　大量的文献表明：抑郁症患者体内的细胞因子如IL-1、IL-6、NO及TNF-α水平比正常人明显升高，这些细胞因子对抑郁症症状如抑郁心境、快感缺失、疲劳及睡眠障碍的发生发展起到促进作用。经抗抑郁药物治疗后，细胞因子水平较前明显降低。通过腹腔注射脂多糖(LPS)或者经过21天慢性不可预测性应激均可导致大鼠的行为性抑郁以及大鼠脑内细胞因子含量增加。细胞因子在脑内可作用于海马区域抑制其神经发生，而海马区神经发生减少也参与了抑郁症的发病机制。注射抗抑郁药物后可对抗这种作用。在细胞水平，大鼠脑胶质细胞系体外培养经过LPS或者IFN-γ等刺激后其分泌细胞因子水平明显升高，给予抗抑郁药物可以明显抑制胶质细胞系的活化增殖，而且减少了细胞因子分泌。　　本实验通过观察氟西汀对大鼠星形胶质细胞活性的影响及其对脂多糖刺激的星形胶质细胞对IL-6及TNF-α分泌作用的影响，来验证抗抑郁药对大鼠胶质细胞系细胞因子分泌存在抑制作用，从侧面验证细胞因子在抑郁症中的作用并探讨药物作用机制。　　材料和方法：　　1、实验设计　　1.1氟西汀对星形胶质细胞活性的影响　　星形胶质细胞按照一定细胞浓度接种到96孔板中，利用（0,1,5,10,20,40,60）μΜ氟西汀孵育细胞24h、48h、72h。利用MTT法观察各浓度、时间细胞活性的变化。　　1.2氟西汀对LPS诱导的星形胶质细胞分泌细胞因子的影响　　将一定细胞浓度的星形胶质细胞接种到48孔板，分为对照组、LPS组及氟西汀组，氟西汀组经过（5,10,20,40）μΜ氟西汀预处理24h后，氟西汀组和LPS组同时经1μ/g/ml的LPS刺激24h，对照组加入同体积稀释液。24h后收集上清液，用Elisa法测上清液中细胞因子含量。　　1.3星形胶质细胞分泌IL-6的通路机制研究　　将一定细胞浓度的星形胶质细胞接种到48孔板，分为对照组、LPS组、PDTC组，氟西汀+PDTC组。PDTC组经过（50,100,150,200）μΜPDTC预处理24h后氟西汀+PDTC组经过相应浓度的氟西汀和PDTC预处理24h，PDTC组、氟西汀+PDTC组和LPS组同时经1μ/g/ml的LPS刺激24h，对照组加入同体积稀释液。24h后收集上清液，用Elisa法测上清液中细胞因子含量。　　2、星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定　　2.1原代星形胶质细胞的培养　　取24-48h内新生SD鼠4只，酒精消毒后断头取脑，打开颅骨，剥离脑膜，去掉嗅球，分离大脑皮层，放入2mlDMEM/F12培养基中，用无菌吸管机械吹打约200次，制备神经胶质细胞混悬液。经200目钢网过滤至无菌培养皿中以去除组织碎块，将过滤后的神经胶质细胞混悬液转移至无菌细胞培养箱30min去除成纤维细胞，再将去除纤维细胞的神经胶质细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶，加入含10％FBS的DMEM/F12，放入细胞培养箱培养，24h后首次换液，此后每隔2-3d换液，培养约21d，星形胶质细胞和小胶质细胞均可成熟。　　2.2星形胶质细胞的分离纯化和鉴定　　混合胶质细胞在培养21d后，用1：4胰酶将星形胶质细胞与小胶质细胞初步分离，定轨摇床法纯化星形胶质细胞，行GFAP免疫荧光检测，鉴定并估算星形胶质细胞纯度。　　3、MTT法检测星形胶质细胞的活性　　分别用浓度为0μΜ、1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ、60μΜ的氟西汀孵育星形胶质细胞24h、48h、72h，用MTT法检测不同氟西汀浓度及时间星形胶质细胞的活性。　　4、IL-6及TNF-α检测　　纯化的星形胶质细胞按照2×104或1×105接种到48孔板中，经过（5、10、20、40）μΜ的氟西汀、（50、100、150、200）μΜ的PDTC处理后再用经过1μg/ml的LPS刺激，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测星形胶质细胞IL-6及TNF-α的分泌情况。　　5、统计方法　　应用Excell2003和SPSS16.0统计软件进行统计分析。结果以均数±标准差（x±S）表示，采用方差分析进行比较，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用DunnettT3检验。以P≤0.05为差异具有显著性，P≤0.01为差异具有高度显著性。　　结果：　　1.星形胶质细胞的培养、分离、纯化及鉴定　　星形胶质细胞在培养24h之后就有部分细胞贴壁，24h之后经过第一次更换细胞培养液（简称换液），去除没有贴壁的细胞及残留的组织碎片，此后每隔2-3d换液，在经过21d后星形胶质细胞已经成熟。星形胶质细胞经过胰酶初步消化分离后，GFAP细胞免疫荧光结果显示，阳性细胞率仅在75%以上。经过定规摇床法进一步纯化星形胶质细胞，显微镜下观察，细胞贴壁生长良好，形态正常，可见星形胶质细胞的细胞突起较明显，长短不一，细胞质丰富，胞内呈卵圆形的细胞核清晰可见。星形胶质细胞经GFAP免疫荧光染色后，荧光显微镜下观察：阳性星形胶质细胞发射出绿色荧光，计数阳性细胞纯度在95%以上。结果表明，定轨摇床法可以得到高纯度的星形胶质细胞，其纯度至少为95%，为下一步的实验过程提供了纯度较高的星形胶质细胞。　　2.氟西汀对体外培养大鼠星形胶质细胞活性的影响及LPS诱导细胞对TNF-α及IL-6分泌的影响及其作用机制　　2.1氟西汀对体外培养星形胶质细胞活性的影响　　相关研究已经发现抗抑郁药物能够促进大脑神经元的神经发生，减少炎性细胞因子对神经元的损害，星形胶质细胞为神经胶质细胞中数量庞大的一种细胞，炎性细胞因子及自身分泌的细胞因子对其的损害更是相当的广泛。本实验中直接加入不同浓度的氟西汀分别刺激24h、48h及72h，观察不同氟西汀浓度及时间对星形胶质细胞活性的影响。　　2.1.1相同时间不同浓度氟西汀刺激对星形胶质细胞活性的影响　　氟西汀浓度为（0，1，5，10，20，40，60）μΜ分别孵育星形胶质细胞24h、48h及72h，MTT法检测星形胶质细胞的活性。结果显示：氟西汀孵育星形胶质细胞24h后，氟西汀浓度为（20，40，60）μΜ时其OD值为（0.2291±0.01383，0.2447±0.01155,0.2714±0.01631），对照组OD值为（0.1979±0.01697），与对照组相比，差异具有显著性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；氟西汀孵育星形胶质细胞48h后，氟西汀浓度为60μΜ时OD值（0.0329±0.00150）与对照组（0.2746±0.02443）及其它各组相比，差异具有高度显著性（P＜0.01），其他浓度组与对照组相比差异无统计学意义；氟西汀孵育星形胶质细胞72h后，OD值在浓度为（10，20，40）μΜ时（0.3553±0.01176,0.3480±0.00851,0.3167±0.00973）与对照组（0.2421±0.02311）及氟西汀浓度为60μΜ（0.0619±0.00521）相比差异具有显著性（P＜0.05，P＜0.01），OD值在氟西汀浓度为60μΜ时与对照组相比，差异具有高度显著性（P＜0.01）。　　2.1.2、相同氟西汀浓度不同时间刺激对星形胶质细胞活性的影响　　氟西汀孵育24h、48h及72h后，氟西汀浓度为1μΜ时：其OD值分别为（0.1943±0.0106）、（0.2920±0.01483）及（0.3029±0.04246），48h、72h与24h相比，差异具有显著性（P＜0.05）；氟西汀浓度为5μΜ时：其OD值分别为（0.2095±0.02023）、（0.2850±0.00696）、（0.3144±0.00268），各组之间差异具有显著性（P＜0.05）；氟西汀浓度为10μΜ时：其OD值分别为:（0.2131±0.01724）、（0.2938±0.01413）、（0.3553±0.91176），各组之间差异具有显著性（P＜0.05）；氟西汀浓度为20μΜ时：其OD值分别为（0.2291±0.01383）、（0.2967±0.02622）、（0.3480±0.00851），各组之间差异具有显著性（P＜0.05）；氟西汀浓度为40μΜ时：其OD值分别为（0.2447±0.01155）、（0.2679±0.01989）、（0.3167±0.00973），72h与24h、48h之间比较差异具有显著性（P＜0.05），24h与48h比较差异不具有显著性（P>0.05）；氟西汀浓度为60μΜ时：其OD值分别为（0.2714±0.01631）、（0.0329±0.00150）、（0.0619±0.00521），各组之间差异具有显著性（P＜0.05）；　　综上，氟西汀在一定的浓度及时间范围内对星形胶质细胞增殖活性大致呈现剂量-时间依赖性，随着浓度及时间的增加，氟西汀促进星形胶质细胞的增殖活性，但是当氟西汀浓度达到60μΜ孵育星形胶质细胞48h或者72h，星形胶质细胞的活性明显下降，可能是此浓度培养达48h或者72h后，对星形胶质细胞起到毒性负作用。　　2.2.氟西汀对LPS诱导的星形胶质细胞分泌TNF-α及IL-6的影响及其机制　　2.2.1脂多糖对大鼠星形胶质细胞分泌TNF-α及IL-6的诱导作用　　将纯化的星形胶质细胞按照2×104细胞/孔或1×105细胞/孔细胞密度接种到48孔板中，分为对照组和LPS刺激组，LPS刺激组用1μg/ml的LPS刺激星形胶质细胞，对照组加入相同体积的LPS稀释液（含10%FBSDMEM/F12），孵育24小时后收集上清液，进行Elisa法检测上清液中TNF-α及IL-6的含量。结果显示：经过LPS刺激24h后，TNF-α含量（53.84±24.84）pg/ml较对照组（8.01±10.87）pg/ml明显升高（P＜0.01），IL-6含量（10633±782.15）pg/ml与对照组（1975.46±171.54）pg/ml相比，差异具有高度显著性（P