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目的以培养的大鼠初级感觉神经元及大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）为研究模型，研究白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）对蛋白激酶活化受体4（protease-activated receptor-4，PAR4）在DRG初级感觉神经元表达的影响。观察PAR4受体及其活化的细胞内机制，从而为进一步阐明PAR4参与外周疼痛信号的调节作用，为外周疼痛的治疗提供实验依据。方法1.初级感觉神经元的分离和培养雄性Wistar大鼠，体重约200g，应用0.4%戊巴比妥钠，2ml，腹腔麻醉后，急性分离大鼠背根神经节（DRG），取双侧DRG，胰酶消化、均匀吹打，制成细胞悬液，种于六孔培养板，进行初级感觉神经元培养。2. IL-1β的孵育本实验分为四组：对照组（IL-1β，0ng/ml），IL-1β（25ng/ml）组，IL-1β（50ng/ml）组，IL-1β（100ng/ml）组。DRG神经元培养24小时后，加入不同浓度的IL-1β（IL-1β终浓度分别为0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml），孵育、培养大鼠的DRG感觉神经元，作用4小时。应用Trizol裂解法提取培养的DRG感觉神经元总RNA，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）核酸扩增技术检测PAR4基因的表达，及IL-1β诱导下对PAR4的基因表达的影响。3．雄性Wistar大鼠，体重约200g，应用0.4%戊巴比妥钠，2ml，腹腔麻醉后，在大鼠的椎旁肌、椎旁皮下及L5/6椎间盘，注射IL-1β（0.5ml，50ng/ml）4小时后，急性分离L4、L5、L6的神经节，4%多聚甲醛液固定，冰冻切片8μm，利用免疫荧光方法结合荧光显微镜技术，观察PAR4在大鼠DRG感觉神经元的表达。4. PKC激动剂（phorbol12-myristate13-acetate,PMA325nm）,PKC抑制剂（chelerythrine chloride,5nm),预先孵育1小时，再应用IL-1β（50ng/ml）作用于DRG感觉神经元，培养4小时， Trizol裂解法提取培养的DRG感觉神经元总RNA，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）核酸扩增技术检测PAR4基因的表达，及PKC激动剂及抑制剂对IL-1β调控PAR4基因表达的影响。5.分别注射PKC激动剂（0.5ml,20ng/mL）和抑制剂（0.5ml,20ng/mL），到大鼠的椎旁肌、椎旁皮下及L5/6椎间盘，作用1小时后，再注射IL-1β（0.5ml，50ng/ml）到椎旁肌、椎旁皮下及L5/6椎间盘，4小时。本实验分为四组：对照组（IL-1β，0ng/ml；PKC激动剂及抑制剂，0ng/ml），IL-1β+PKC激动剂组，IL-1β组，IL-1β+PKC抑制剂组。急性分离L4、L5、L6的神经节，4%多聚甲醛液固定，冰冻切片8μm，利用免疫荧光方法结合荧光显微镜技术，观察PAR4在大鼠DRG感觉神经元的表达，分析应用PKC激动剂和抑制剂干预后的白介素诱导下的PAR4的表达。结果1. DRG内神经元的PAR4的分布免疫荧光组织化学结果显示，未应用IL-1β作用的大鼠背根神经节的神经元表达PAR4，阳性细胞多为中小型细胞,部分大型神经元也呈PAR4阳性表达。可见有27.31±0.49%神经元呈PAR4阳性，形态呈圆形或卵圆形，阳性标记物主要出现在细胞膜、细胞浆，细胞核未见标记。2. IL-1β注射后DRG内神经元的表达变化应用IL-1β干预4小时后，急性分离L4、L5、L6背根神经节的神经细胞，应用免疫组化方法，可见大量的感觉神经元表达PAR4阳性。可见有63.39±0.54%神经元呈PAR4阳性（阳性细胞计数均采用药物注射椎间盘组的切片观察分析），PAR4阳性细胞数较正常的背根神经细胞明显增多，与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。部分细胞PAR4荧光标记增强，阳性细胞多为中小型细胞,大型神经元也呈PAR4阳性表达，形态呈圆形或卵圆形，阳性标记物主要出现在细胞膜、细胞浆，细胞核未见标记。在神经节部分神经元纤维也成呈PAR4阳性表达。3. IL-1β对PAR4mRNA在初级感觉神经元表达的影响RT-PCR结果显示：不同浓度的IL-1β使PAR4mRNA的表达量明显增加，并随着IL-1β浓度增加，表达量增加，呈正相关系增加,分别为对照组的1.04倍、1.18倍、1.24倍。不同浓度IL-1β组与空白对照组比较，均有统计学意义（P<0.05），不同浓度的IL-1β组比较，也有统计学意义（P<0.05）。4. PKC激动剂和抑制剂对IL-1β诱导PAR4mRNA表达时的调节作用RT-PCR结果显示：IL-1β及PKC激动剂组使PAR4mRNA的表达量明显，且PKC激动剂组表达较IL-1β组表达增加，PKC激动剂+IL-1β组是单纯IL-1β组的1.11倍，有统计学意义（P<0.05）；而PKC抑制剂使IL-1β干预后的PAR4mRNA的表达量明显降低，与单纯IL-1β组相比PAR4mRNA的表达量明显下降，是其0.88倍，有统计学意义（P<0.05）。5. PKC对IL-1β注射后PAR4免疫阳性细胞的表达变化的影响分别在大鼠皮下注射、椎旁肌及椎间盘中，三个部位注射PKC激动剂(0.5ml，20ng/mL)及抑制剂(0.5ml，20ng/mL),1小时，再注射IL-1β（0.5ml，50ng/mL），4小时后，通过免疫荧光组织化学结果显示，L4-L6DRG内的PAR4阳性细胞数明显发生变化，PKC激动剂使得PAR4的表达的阳性细胞数明显增多，与IL-1β组相比，PKC激动剂+IL-1β组PAR4阳性细胞计数是71.21±0.57%（实验细胞计数均采用药物注射腰椎间盘的组织切片观察分析），有统计学意义（P<0.05），其中仍以中小型细胞为主,部分大型神经元表达；PKC抑制剂使得PAR4的表达的阳性细胞数明显减少，与IL-1β组相比，PKC抑制剂+IL-1β组PAR4阳性细胞计数是21.93±0.33%（实验细胞计数均采用药物注射腰椎间盘的组织切片观察分析），有统计学意义（P<0.05），部分阳性细胞荧光显示的亮度减弱，大、中、小细胞数量减少上没有明显差异。结论1.免疫荧光显示，大鼠DRG部分中小型初级感觉神经元呈PAR4免疫细胞化学标记阳性。2.在大鼠的椎旁肌、皮下及椎间盘注射IL-1β，4小时后， PAR4阳性神经元表达较未行IL-1β注射组均增加，主要是一些中小型细胞，部分大细胞也存在表达3.不同浓度的IL-1β作用于体外培养的大鼠DRG初级感觉神经元，PAR4mRNA表达量明显增加，且IL-1β浓度与PAR4mRNA表达呈正相关系。说明IL-1β对PAR4mRNA表达的起到一定的调控作用4. PKC激动剂增强IL-1β对PAR4mRNA调节作用，相反，PKC抑制剂降低IL-1β对PAR4mRNA调节作用；同样预先在大鼠的椎旁肌、皮下及椎间盘注射PKC激动剂或抑制剂,能够增加或减少DRG内PAR4阳性神经元的数量。表明PKC信号参与IL-1β对DRG初级感觉神经元PAR4的调节作用。