GMC基因家族(glucose-methanol-cholinegenefamily)是指存在于生物有机体中的一大类以黄素腺嘌呤二核苷(FAD)为辅酶的氧化还原酶类基因,此基因家族所表达的蛋白含有同源的骨架结构,被命名为GMC氧化还原酶家族(glucose-methanol-cholineoxidoreductasefamily)。这类基因最初在微生物中发现,大量存在于昆虫和脊椎动物中,但在线虫和高等的脊椎动物中很少或没有发现此类基因。GMC氧化还原酶功能各异,可催化不同的反应,现在至少可以划分出11种功能,然而关于GMC基因家族的具体基因功能研究还不是很多。　　 Iida(2007)的研究发现,昆虫基因组中含有大量的GMC基因家族基因,在昆虫中,此类基因家族的大多数基因成簇的串联排布在高度保守的GMC基因簇中,这个基因簇包含在一个很大的内含子flotillin-2内。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,其遗传学、生理生化、病理学的研究已有大量报道,尤其家蚕基因组学研究在近十年来更是长足发展,但家蚕GMC基因家族的研究却几乎还是个空白。通过分析,我们发现家蚕中存在43个GMC氧化还原酶类基因,而且它们在家蚕基因组中的分布情况与Iida研究中的昆虫相一致。　　 本研究是在家蚕基因组数据库的基础上,选取了家蚕GMC基因家族中的一个基因-BmGMCβ2作为研究对象,对其进行克隆、表达及功能初探,经以上研究鉴定该基因的功能。主要研究结果如下:　　 1、BmGMCβ2基因的克隆及序列分析　　 基于家蚕基因组数据库,设计引物并克隆了目的基因BmGMCβ2。通过生物信息学分析我们发现,BrnGMCβ2基因全长1875bp,编码624个氨基酸。预测蛋白质分子质量为69.3kD,等电点(pI)为6.21。该基因位于家蚕16号染色体的scaf3058上,含GMC基因家族所共有的ADP-Bindingβ-α-β折叠结构域。进化分析表明,该基因是家蚕GMC基因家族β亚家族成员。　　 2、BmGMCβ2基因的表达特征分析　　 利用RT-PCR技术分析BmGMCβ2基因在家蚕不同发育时期和不同组织的表达模式。结果显示,BmGMCβ2基因在家蚕5龄盛食期表达量较高。在组织层面上,BmGMCβ2基因主要是在表皮、脂肪体和气管中表达,且此基因的转录在组织分布上没有性别差异。　　 3、BmGMCβ2基因的原核表达和多克隆抗体制备　　 将扩增好的带有特定酶切位点的BmGMCβ2基因片段酶切后,亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,然后转化到大肠杆菌BL21表达菌株中进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,在69kD左右出现一条与预测蛋白大小相一致的较浓条带,确定其为目的蛋白。目的蛋白经His-层析纯化柱纯化后制备多克隆抗体。然后用Westernblotting技术检测原核表达的目的蛋白,在69kD左右处出现特异的杂交信号,说明制备的抗体具有良好的特异性,可用于下一步研究。　　 4、GMCβ2蛋白在家蚕中的组织定位　　 利用Westernblotting技术检测GMCβ2蛋白在家蚕各组织中的分布情况,结果显示,该蛋白主要在家蚕脂肪体中表达。然后我们还通过免疫组化的方法,在脂肪体组织中探测到了杂交信号,证实了该基因在家蚕脂肪体组织中的蛋白表达情况。　　 5、BmGMCβ2基因的功能初探　　 用病原微生物G-菌(沙雷氏菌,S.aureus)、G+菌(黑胸败血菌,B.beauveria)和真菌(白僵菌,B.bassiana)添食家蚕后,利用荧光定量PCR技术检测BmGMCβ2基因的诱导表达情况。结果显示,经G+菌和真菌诱导的家蚕,BmGMCβ2基因表达量明显上调;经G-菌诱导的家蚕,BmGMCβ2基因表达量并没有上调。这表明BmGMCβ2基因可能与家蚕先天性免疫的Toll信号通路有关。