套式病毒是一类有囊膜的单股正链RNA病毒，可以感染哺乳动物、禽类以及无脊椎动物等。其典型特征是在其复制酶基因下游可转录出一套含有共同3’末端的亚基因组mRNA。套式病毒中比较重要且研究较多的有动脉炎病毒科（Arteriviridae）和冠状病毒科（Coronaviridae）。本论文从两科中分别选取了具有代表性的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV）和鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)作为研究对象，对PRRSV的核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）和MHV的辅助蛋白ns2的结构与功能关系进行了解析，并将研究内容延伸到与ns2结构相似的轮状病毒A型（RotavirusA，RVA）VP3蛋白。PRRSV可分为北美型和欧洲型，两基因型间在核苷酸水平只有约60%的相似性。该两基因型毒株几乎同时在两个不同洲出现，感染猪后却引起相似的症状，俗称“蓝耳病”。由开放阅读框7（ORF7）编码的N蛋白是组成病毒颗粒的主要成分。同样的，虽然在型内N蛋白十分保守，但两基因型间的序列差异较大。本文依靠实验室已构建的PRRSV两基因型的感染性克隆为平台，通过型间替换、氨基酸点突变、以及借助体外生化和双分子荧光互补等手段来研究了PRRSV N蛋白的结构与功能关系，研究内容简述如下：因PRRSV两基因型间N蛋白的序列差异较大，我们推测其存在重要的保守功能域或者氨基酸位点。我们在北美型感染性克隆基础上，将其N蛋白替换为欧洲型，结果显示：欧洲型的ORF7-3’UTR或者仅ORF7在ORF6和7保持重叠或者拉开情况下均可成功替换北美型。这为我们比较研究两基因型N蛋白的共同关键功能域提供重要基础。通过对PRRSV两基因型N蛋白的氨基酸序列比较，发现对应于北美型第90位半胱氨酸的欧洲型是丙氨酸。而之前的报道称当突变该位点以及第23位半胱氨酸为丝氨酸时是致死性的，并认为该两半胱氨酸对病毒的包装等十分重要。本研究大胆假设这些位点是可以被丙氨酸替代的。结果显示：北美型和欧洲型的所有半胱氨酸均可突变为丙氨酸，且突变体的生长特性与亲本病毒相似，进而否定了之前的研究结论。为了探究N蛋白的半胱氨酸功能，采用体外生化手段对半胱氨酸形成二硫键介导二聚体的形成作了解析。结果显示：在病毒感染或者真核表达质粒转染的细胞裂解物中，北美型N蛋白的第23位或者欧洲型的第27位半胱氨酸可以形成二硫键，但是可以被烷化剂阻断，说明二硫键介导形成的二聚体是裂解过程中人为造成的；然而，在胞外纯化的病毒粒子里，N蛋白形成二聚体不能被烷化剂阻断，检测到了单体和二聚体的共存，说明在成熟的病毒颗粒中半胱氨酸可能起稳定核衣壳的作用，但这不是必须的。为了进一步解析N蛋白参与病毒粒子组装的机制，本文构建了双分子荧光互补系统并用来研究N蛋白的相互作用关系。结果显示：两基因型N蛋白都存在不依赖于半胱氨酸的非共价相互作用；且在N蛋白的N端之间、C端之间、N端与C端之间存在分子间或者是分子内的相互作用。这说明N蛋白间的非共价键作用对其形成二聚体、参与病毒粒子的组装尤为重要。上述借用了PRRSV反向遗传操作为平台对N蛋白的结构与功能关系作了探索研究，对病毒颗粒的组装机制有了新的认识，并对其它类病毒的研究亦借鉴意义。在对“小”套式病毒即动脉炎病毒PRRSV的结构蛋白N作了结构与功能关系解析后，本论文将研究延伸到了“大”套式病毒即冠状病毒MHV的辅助蛋白ns2。ns2是属于II类的2H磷酸酯酶超家族成员，其典型的特征是含有两个HxT/S催化基序。经研究证实，ns2是一个2’,5’-磷酸二酯酶（2’,5’-PDE），它可以直接切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶（2’,5’-oligoadenylate synthetase，OAS）合成的2’,5’-寡腺苷酸（2-5A），阻止细胞核糖核酸酶RNase L的激活，进而阻断其对宿主和病毒RNA的降解，具有抗先天免疫功能，它对MHV在肝脏中的有效复制和肝炎发生是必须的。经结构预测分析发现，RVA的VP3的C端区域（VP3-CTD）也有相似的结构域，而之前有报道称VP3是一个毒力因子。为了验证VP3是否也和ns2一样具有PDE活性、能否拮抗OAS-RNase L先天免疫通路，本文借助体外的生化试验以及依据MHV反向遗传平台构建表达VP3的嵌合病毒，在体外细胞和体内动物试验方面来研究MHV ns2与RVA VP3的结构与功能相似关系，研究内容如下：鉴于MHV ns2和RVAVP3-CTD都有两个HxT/S催化基序，但它们的一级氨基酸序列差异较大，通过同源建模，创建了拥有较高置信度的ns2和VP3-CTD结构，结果显示：两者结构相似，两个催化基序在各自的结构中都位于相似的区域，说明两者可能拥有相似的功能。基于结构分析比较，将ns2和VP3-CTD及其突变体经大肠杆菌表达纯化，验证是否有磷酸二酯酶活性。结果显示：ns2和VP3-CTD均可以降解2-5A，而VP3-CTD的突变体却不能，说明VP3-CTD有体外直接切割2-5A能力。为从细胞水平证明，将构建的ns2和VP3-CTD及其突变体真核表达载体转染细胞。结果显示：有ns2或VP3-CTD表达的细胞检测到较低水平2-5A，而VP3-CTD突变体则检测到显著的2-5A水平，说明在细胞内VP3-CTD有降解2-5A能力。因MHV ns2突变体在B6小鼠的BMM和肝脏中复制能力受到限制，采用了嵌合表达VP3-CTD来补偿ns2突变体方法来进一步验证。借用MHV感染性克隆，构建了表达VP3-CTD的嵌合MHVs。结果显示：嵌合表达VP3-CTD可以在B6BMM上有效复制且可以抑制核糖体RNA的降解；VP3-CTD突变体则同MHV ns2突变体一样复制受到限制，且RNA被降解明显；在RNase L-/-小鼠的BMM上，所有病毒复制无差异。说明VP3-CTD在细胞内可补偿ns2突变体的功能。为检测嵌合表达VP3-CTD的病毒在感染小鼠后可否功能性的补偿ns2突变体，将嵌合病毒感染B6和RNase L-/-小鼠。结果显示：表达野生型VP3-CTD可以恢复ns2突变体在B6小鼠中的复制能力，但是突变的VP3-CTD则不能。在RNase L-/-小鼠中，突变的VP3-CTD嵌合病毒的滴度可以回复到野生型的VP3-CTD水平。说明VP3-CTD在体内可补偿ns2突变体的功能。通过对MHV ns2和RVA VP3-CTD的体外和体内的比较研究证实，VP3-CTD和ns2一样，拥有2’,5’-磷酸二酯酶活性，可以切割2-5A，进而拮抗先天免疫途径OAS-RNase L。这对探求MHV与RVA的病毒起源进化，以及研发抑制VP3-CTD活性的药物，对疾病防治等提供思路。综述所述，本论文主要借助了反向遗传操作平台，结合生化等手段，对动脉炎病毒PRRSV N和冠状病毒MHV ns2以及延伸到轮状病毒RVAVP3蛋白的结构与功能关系作了对比探索研究，这加深了我们对套式病毒的颗粒组装机制和抗宿主免疫逃避机制的认识了解。