角膜（cornea）是位于眼球最前部的一层透明膜，能为眼睛提供大部分的屈光力，加上晶体的屈光力，便可使光线准确聚焦在视网膜上成像。人角膜基质（HumanCorneal Stroma, HCS）是角膜构成的主要部分，占角膜厚度的90%，在维持角膜透明及允许光线穿过中具有至关重要的作用。很多原因均可引起HCS发生异常性病变，且HCS病变具有患病率高、致盲性强和临床治疗困难等特点。目前唯一的治疗办法是进行角膜移植术，但由于捐献角膜的高度匮乏，致使绝大多数叫膜基质异常患者因无法得到供体角膜而不能复明。近年来，角膜组织工程的兴起使体外重建组织工程人角膜基质（Tissue-Engineered Human Corneal Stroma, TE-HCS）成为可能，也给众角膜基质异常患者带来了重见光明的希望。在TE-HCS的体外重建中，大量正常HCS种子细胞的来源和理想载体支架的获得是急需解决的两个关键问题，尤其是HCS种子细胞的来源问题更是制约TE-HCS规模化体外重建的瓶颈。虽然已有利用癌基因转染建立人角膜基质人角膜基质细胞（Human Corneal Stromal Cell, HCSC）细胞系的报道，但因这类细胞具有潜在致瘤性而无法应用于临床，而建立非转染、无致瘤性的HCSC细胞系被认为是解决大量正常HCS种子细胞来源问题的希望。但目前为止，仍未见成功建立非转染、无致瘤性的HCSC细胞系有关报道。为了解决HCSC种子细胞来源问题，本文利用胰酶消化联合组织块贴壁法启动了HCSC的原代培养，通过添加促贴壁、生长和分裂的物质获得可继代培养的HCSC，建立非转染HCSC细胞系，并对其细胞属性、功能蛋白表达和致瘤性进行鉴定，进而利用克隆化培养方法从此细胞系中筛选出单克隆细胞株，经扩增培养后再次进行细胞属性等鉴定，为利用细胞属性正常的单克隆细胞株开展HCSC相关理论研究和TE-HCS的体外重建研究奠定基础。为了建立非转染HCSC细胞系，本文将撕除角膜内皮层和上皮层得到的HCS片进行了胰蛋白酶适度消化，然后将组织块平贴于用明胶包被的24孔板中，加入含5%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的DMEM/F-12培养液置37℃、5%CO2培养箱中启动原代培养。24h后将培养液更换为HCSC专用培养液，即含有碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）、表皮生长因子（EpidermalGrowth Factor，EGF）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）、羧甲基壳多糖（Carboxymethyl Chitosan，CM-CH）和20%FBS的DMEM/F-12完全培养液。跟踪观察发现，启动培养2d后组织块周围开始有纤维样细胞迁出，14d便可长成完整的细胞单层，进而利用HCSC专用培养液成功进行了继代培养。观察结果显示，HCSC贴壁能力强，在体外呈现稳定的成纤维样细胞形态，且生长分裂旺盛并能稳定持续传代，细胞经冻存复苏后依然保持良好的生长状态和增殖能力，现已传至第40代。为了鉴定所建立的非转染HCSC细胞系的属性和潜能，本文对第40代HCSC细胞的形态、生长特性、核型以及功能蛋白的表达等进行了鉴定。细胞属性检测结果显示，第40代HCSC依然呈典型的成纤维样细胞形态，能活跃生长和分裂，其群体倍增时间为41.44h，该细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性，但其特征性染色体数目依然46条，并具有典型的人类染色体特征；对HCSC细胞系的免疫荧光检测结果显示，该细胞系细胞仍具有HCSC特异性标志蛋白——波形蛋白的阳性表达，综合核型特征可知，本文所建立的非转染细胞系确为HCSC细胞系。为了鉴定所建立细胞系的潜能，本文又对该细胞系细胞进行了功能蛋白——细胞连接蛋白和膜运输蛋白表达的免疫荧光检测，发现该细胞系仍具有细胞连接蛋白——间隙连接蛋白CX-43和整联蛋白β1的阳性表达，也保持有膜运输蛋白——钠钾泵和钙泵的阳性表达，表明该细胞系细胞仍具有形成细胞间以及细胞与细胞外基质间细胞连接的潜能，还保持有对Na+、K+和Ca2+主动运输的潜能。可见，本文所建立的非转染细胞系不仅具有HCSC的属性，而且还保持有细胞连接蛋白和膜运输蛋白的阳性表达，具有行使正常HCSC功能的潜力。为了获得可用于TE-HCS体外重建的核型正常的HCSC种子细胞，本文又利用克隆化培养技术对已建立非转染HCSC细胞系进行了克隆化研究。利用有限稀释法对HCSC细胞系进行了克隆化实验，共获得了15个单克隆细胞株，核型鉴定结果显示，有3个单克隆细胞株的染色体数目为46条且具有正常二倍体核型。取其中一个单克隆细胞株C5G再次进行生长特性的鉴定和标志蛋白表达的检测。鉴定与检测结果显示，该单克隆细胞株细胞群体倍增时间为40.39h，仍保持有旺盛的生长分裂活性，并具有波形蛋白的阳性表达，说明该细胞株确为HCSC单克隆细胞株，可被用作种子细胞进行TE-HCS及全层角膜的体外重建研究。综上所述，本文成功建立了细胞属性和功能蛋白表达正常的非转染HCSC细胞系，并从中筛选出了细胞属性正常的单克隆细胞株，初步解决了足量HCSC种子细胞的来源问题，为TE-HCS及全层角膜的规模化体外重建及其临床应用创造了条件。