海藻希瓦氏菌对半滑舌鳎致病性及诱导肠道免疫相关基因差异表达研究

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从患病半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体内分离一株革兰氏阴性菌,将菌株命名为CSG-15,经过生理生化鉴定及16S rDNA测序鉴定为海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)。CSG-15与海藻希瓦氏菌标准菌株ATCC51192(NR117771)和YJ06114(EF542799)相似性最高,其次是菌株MAS2737(GQ372875)。其序列同源性相似度分别为99.86%、99.86%、99.80%。基于16S rDNA序列构建的系统发育树显示,CSG-15与海藻希瓦氏菌ATCC51192和YJ06114聚为一支。回归感染实验后计算半致死浓度(LD50)为1.0×106 CFU/g。肠道组织病理变化明显,主要有肠绒毛变钝、溶解、脱落,且大量炎性细胞浸润肌肉层和粘膜下层。药物敏感性实验结果显示菌株CSG-15对氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮、大环内酯类和氨基环醇类抗生素敏感。CSG-15可在0-50 ppt,pH 6-10,2-50°C环境条件下生长,具有很强的环境适应能力。其最佳生长条件为pH 7,30 ppt,30°C,而且具有明显的四个生长阶段:潜伏期(0-2 h)、对数生长期(2-8 h)、稳定期(8-24 h)和衰亡期(24 h后)。首次从患病半滑舌鳎体内分离出海藻希瓦氏菌。这为希瓦氏菌属菌种的鉴定、预防和治疗因海藻希瓦氏菌感染而引起的水产动物疾病提供了科学的参考依据。通过16S rDNA高通量测序方法研究人工感染海藻希瓦氏菌半滑舌鳎肠道菌群结构变化情况,分别于感染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h时间点收集半滑舌鳎肠道微生物。测序结果分析表明,5组半滑舌鳎肠道样品经测序后,聚类共得到4545个OTU,CSH与CSY共有的OTU数目为902个。从整体看,未感染前OTU数目最少(1169);感染后OTU数目逐渐增多,72 h(CST)时达到了峰值(3099);而72 h(CST)-96 h(CSY)OTU数目显著回落,96 h(CSY)OTU数目(1780)与48 h(CSS)(1633)相似。本实验物种丰富度及多样性结果分析表明,人工感染海藻希瓦氏菌0 h-72 h内,半滑舌鳎肠道微生物数量及种类逐渐增多,且72 h时达到峰值;从72 h开始,微生物数量及种类开始减少,到96 h时逐渐趋于正常值。在Beta多样性研究中结果显示组CSY(96 h)与CSH(24 h)聚为一支,组CSB(0 h)与CSS(48 h)聚为一支,而CST(72 h)与CSB和CSS聚为一支。所以半滑舌鳎感染海藻希瓦氏菌后,其肠道微生物多样性24 h与96 h相似,0 h与48 h相似,而与其它组相比,72 h与0 h和48 h更为相近。研究水产动物发病过程中肠道内的优势菌种的种类及条件致病菌丰度的变化规律,可为进一步确定半滑舌鳎腹水病病因提供了线索,并对预防及控制该病的提供理论基础。建立海藻希瓦氏菌感染半滑舌鳎的动物模型,分别对正常与感染半滑舌鳎肠道组织进行转录组测序,分析肠道免疫相关基因的差异表达情况。结果表明,9个样品共鉴定到23356个基因,其中STH-1、STH-2、STH-3、STZ-1、STZ-2、STZ-1、STR-1、STR-2和STR-3鉴定出的基因数目分别为19604、19534、20267、19568、19773、19530、19736、19799和19179,各样品基因所占比例分别为83.94%、83.64%、86.77%、83.78%、84.66%、83.62%、84.5%、84.77%和82.12%。半滑舌鳎肠道差异表达基因,通过GO、KEGG数据库信号通路分析发现有补体系统、趋化因子、吞噬体、细胞介导细胞毒作用、Rap1信号通路、GF-beta、Jak-STAT、NF-k B等信号通路参与肠道免疫应答过程。通过聚类富集分析来寻找差异表达的免疫相关基包括AMBP、FGB、CFD、C9、FGG和CCK等26个。其中,在12 h显著上调的为CCK、PTX3、HSP90B1、SOCS3、TMIGD1、TP53I3和SOCS3;显著下调的为AMBP、FGB、CFD、C9、FGG、VIT、COL6A1、MDK、CALML6、TGFBI、GSN、TAGLN、MDK、PCK1、MAMDC2、VAT1、ABCA12、FHL1和ID4。随后选取基因SOCS-3、CCK、COL6A1、TGFBI、FHL1和HSP90B1进行进行荧光定量PCR验证,实验结果与RNA-seq检验结果趋势几乎一致。本研究首次对海藻希瓦氏菌感染诱导肠道免疫应答进行转录组分析,有助于了解鱼类肠道黏膜免疫系统的分子机制。
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