论文部分内容阅读
三叉苦,又名三丫苦、三桠苦、三叉虎,为岭南特色地产药材。《广东省中药材标准》收载其为芸香科植物三叉苦Melicope pteleifolia（Champ.ex Benth.）Hartley的干燥茎及带叶嫩枝[1]。具有极高的药用价值,为多种中成药的处方原料药,临床及民间运用广泛。三叉苦历来以野生药材入药,主要分布于广东、广西、海南、福建、江西等岭南地区,在广东省内广泛分布。近年来,随着三叉苦药用需求量的日益增大,两广地区的野生资源蕴藏量逐渐减少,不仅药用需求得不到保障,其种质资源遗传多样性亦遭受严重破坏。为了确保三叉苦种质资源的可持续利用,有必要系统开展三叉苦种质资源遗传多样性研究,摸清其种质状况,为三叉苦种质资源保护与优良种质筛选奠定基础。三叉苦的药用部位比较混乱,不同的药材标准及本草书籍收载的药用部位分别有茎及带叶嫩枝、茎、全株、枝叶、根等,功能主治表述则基本一致。目前,三叉苦商品药材来源主要依靠野生资源,以茎居多,且茎的粗度大小不一,产地不明,造成三叉苦市场混乱、质量参差不齐,严重影响用药要求。为了确保三叉苦药用部位规范使用和药材质量标准化,仍需系统开展三叉苦药材质量分析与评价等工作。目的:开展三叉苦种质资源遗传多样性研究,分析其种群的遗传结构,为三叉苦种质资源保护与优良种质筛选奠定基础;对不同产地和不同部位三叉苦药材质量进行系统的分析与评价,为三叉苦药材及成方制剂的质量控制提供科学依据。方法:1.三叉苦种质资源ISSR遗多样性分析设定影响三叉苦ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,对条件进行优化,并筛选引物及退火温度,建立三叉苦ISSR-PCR最适反应体系,利用建立的反应体系对广东13个居群的三叉苦种质资源DNA进行扩增,采用POPGENE 32和NTSYS-pc2.1软件系统对不同居群的三叉苦种质资源进行遗传多样性分析和聚类分析。2.三叉苦白鲜碱和茵芋碱的含量测定分别对供试品溶液的制备方法、HPLC色谱条件等进行考察,建立三叉苦中白鲜碱和茵芋碱的HPLC含量测定方法。利用建立的方法分别对不同居群和不同部位的三叉苦药材中茵芋碱和白鲜碱的含量进行测定。3.三叉苦总黄酮的含量测定分别采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法和AlCl3络合分光光度法对三叉苦中总黄酮的含量进行测定,分析比较测定结果,优选显色方法。利用正交实验设计对供试品溶液的提取条件进行考察,建立三叉苦总黄酮含量的测定方法,并对不同居群和不同部位三叉苦药材中的总黄酮含量进行测定。4.三叉苦茎HPLC指纹图谱的研究与制定分别对供试品溶液制备的提取溶剂、流动相体系、洗脱条件及检测波长分别进行考察,初步建立三叉苦茎的HPLC指纹图谱研究方法。构建28批三叉苦茎的HPLC指纹图谱,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A）进行相似度评价,运用SPSS 22.0统计软件进行主成分分析和聚类分析,并对三叉苦不同部位（根、茎、带叶嫩枝）的HPLC指纹图谱进行比较。结果:1.广东省三叉苦种质资源ISSR遗传多样性分析建立了三叉苦ISSR-PCR最佳反应体系,并从60条ISSR引物中筛选出了扩增条带清晰、多态性好的12条引物。12条引物共扩增出79条条带,其中多态性条带73条,多态位点百分率为90.1%,物种水平PPB为89.86%,Nei’s基因多样性指数（H）为0.3603,Shannon’s信息指数（I）为0.5397;而在种群水平上PPB为33.93%74.29%,均值为51.67%,H为0.09030.3366,均值为0.1736,I为0.15110.4434,均值为0.2486,居群间总的基因多样度（Ht）为0.2417,居群间的遗传分化指数Gst为0.3673,基因流（Nm）为0.8605,各居群间的遗传距离为0.06510.6101。2.三叉苦茵芋碱与白鲜碱含量测定25批三叉苦茎中茵芋碱与白鲜碱的含量差异较大,分别为1.2148.0μg/g和1.2852.7μg/g。其中茵芋碱含量较高的依次为来自茂名新垌镇、茂名那霍镇和湛江遂溪县的样品,而2批商品药材和来自茂名市新垌镇的样品中白鲜碱含量较高。三叉苦同一植株不同部位中茵芋碱和白鲜碱的含量差异明显,根和茎中均含有茵芋碱和白鲜碱,但分布无规律,而带叶嫩枝中没有检测到该种成分。3.三叉苦总黄酮含量测定不同产地三叉苦带叶嫩枝中总黄酮含量有一定差异性,为19.69 mg/g36.00 mg/g,其中韶关始兴县带叶嫩枝中的总黄酮含量最高。根和茎中总黄酮含量都较低,为0.68 mg/g1.09mg/g,而带叶嫩枝中总黄酮含量远远高于根和茎。4.三叉苦茎的HPLC指纹图谱研究以茵芋碱为参照峰标定了13个共有峰,建立了三叉苦茎的HPLC指纹图谱,28批三叉苦药材相似度在0.230.99,有22批相似度在0.9以上,来自信宜、湛江、河源及从化的样品相似度较低,在0.2250.810之间,28批药材被聚成3类,其中亳州药材市场、茂名新垌镇、那霍镇和湛江市的样品为第Ⅰ类;5批商品药材和产自韶关市、贵港市、惠州市、梅州市的野生样品为第Ⅱ类;其余产地的为第Ⅲ类。三叉苦茎的HPLC指纹图谱与根相似,与带叶嫩枝的差别较大。结论:本研究构建了13个不同居群三叉苦种质资源的DNA指纹图谱,摸清了广东省三叉苦种质资源的遗传多样性、种群结构以及亲缘关系。广东省三叉苦种质资源在物种水平上表现出较高的遗传多样性,而在种群水平上遗传多样性为中等偏低水平,不同居群种质资源遗传多样性差异明显,居群内的遗传分化大于居群间,遗传变异主要存在于居群内,三叉苦种质资源亲缘关系的远近与地域相关。本研究对三叉苦优良品种选育和种质资源保护与利用奠定了基础。优化建立的白鲜碱、茵芋碱和总黄酮的含量测定方法及茎HPLC指纹图谱方法,操作可行,结果可靠,为三叉苦药材质量控制方法的完善提供了依据。不同野生居群及不同部位三叉苦药材质量差异较大。根和茎的化学成分种类相似,可等同入药,而带叶嫩枝与根及茎的化学成分差异明显,建议分开入药。本研究为三叉苦药材质量控制和药用部位的选择提供了一定的依据。