研究背景和目的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种临床上常见的危重症,临床表现多由肺血管通透性增加和中性粒细胞浸润引起。目前认为,ARDS是一种失控的炎症反应,多种原因可引起ARDS,但感染仍是ARDS最主要原因之一。在世界各地,ARDS的患病率和死亡率居高不下,而有效的治疗方法仍旧缺乏,因此,深入研究ARDS的必要性和紧迫性不言而喻。细胞间黏附分子 1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)主要功能是介导中性粒细胞与血管内皮细胞间的黏附。当中性粒细胞到达肺部毛细血管时,同内皮细胞膜表面的ICAM-1结合,内皮细胞和中性粒细胞均活化,使得内皮细胞间连接和细胞骨架发生变化,细胞变形而产生缝隙,允许中性粒细胞穿过血管壁进入肺组织,这本身是机体的正常炎症反应过程。但是,在ARDS发生早期,内皮细胞ICAM-1表达急剧增加,引起过多的中性粒细胞肺部浸润,导致了ARDS的发生发展。这一现象在多种原发病因导致的ARDS模型中都得到充分证实。肿瘤坏死因子-a(TNF-a)刺激后,ICAM-1敲除小鼠微小血管通透性和中性粒细胞肺部浸润均减少了70%以上。这些研究表明,在缺失ICAM-1的情况下,ARDS的两个特征性病理生理改变均大大减轻。由此可见,ICAM-1在ARDS发生发展中起重要作用。丝裂原激活蛋白激酶 2(mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2,MK2)是 p38(mitogen-activated protein kinase p38)]下游一个重要激酶,当细胞受到体内外理化刺激后,比如氧化应激、缺血缺氧、严重的外伤等,MK2可以被p38磷酸化激活而发挥重要作用。本课题组前期实验证实在人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)中,MK2可以调节ICAM-1和白介素8(IL-8)的表达,这种调控作用不通过NF-K B通路发挥作用。人抗原R(human antigen R,HuR)是一种广泛分布于人体及其他动物体内的核蛋白,它参与细胞的增殖与分化等重要活动。我们前期研究结果提示,在HPMEC中,当TNF-α刺激后,MK2可以促进HuR从细胞核转移到细胞质,但是HuR细胞总量保持不变,而HuR可以促进白介素6(IL-6)mRNA的稳定性。研究证实HuR可以与多种炎症因子mRNA的3’非翻译区的腺嘌呤尿嘧啶富集区(ARE)结合从而调节mRNA稳定性。ICAM-1的mRNA 3’端非翻译区也存在ARE,我们推测ICAM-1的表达受到HuR的调控,我们实验室在HPMEC细胞模型中也证实MK2在转录后水平通过调节HuR的核质转移来调节ICAM-1的表达。但是在动物实验中,MK2/HuR通路对ICAM-1的调控作用尤其是在肺微血管内皮细胞内的研究尚缺乏。因此,在本次实验中,我们观察了 LPS导致的ARDS小鼠肺微血管内皮细胞内MK2、HuR及ICAM-1的变化情况,同时我们还运用MK2抑制剂MMI-0100干扰MK2的激活,观察MK2、HuR及ICAM-1在小鼠肺微血管内皮细胞内的表达变化。本研究为进一步在小鼠体内干预MK2/HuR,从而影响ICAM-1的表达。研究方法1.小鼠ARDS模型的构建(1)第一部分:体重为(20±3)g、周龄为6-8的雄性C57BL/6小鼠10只,随机平均分成2个组,实验组(LPS组)腹腔注射LPS(5mg/kg),对照组则给予腹腔注射PBS(5mg/kg),24小时处死各组小鼠。(2)第二部分:体重为(20±3)g、周龄为6-8的雄性C57BL/6小鼠15只,随机平均分成3组:对照组腹腔注射PBS(5mg/kg),LPS组小鼠腹腔注射LPS(5mg/kg),LPS + MMI-0100组小鼠0小时每只腹腔注射 LPS(5mg/kg)+ MMI-0100 溶液(0.00lmg/只),6小时、12小时、18小时每只小鼠各腹腔注射MMI-0100溶液(0.OOlmg/只)24小时采取颈椎脱臼法处死各组小鼠。2.小鼠肺组织湿干重比将颈椎脱臼处死的小鼠迅速开胸取肺,将每只小鼠右肺中叶表面血液迅速用吸水纸吸干,称量,记录各肺质量,置于75°C恒温烤箱24小时,烘干后迅速称量各肺质量,计算各组小鼠肺组织湿干重比(wet/dry,W/D)。3.肺组织HE切片观察摘取各组小鼠右肺上叶,将取下的肺组织用PBS溶液冲洗一下,立即放入10%甲醛固定2小时,流水冲洗6小时,标本依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水,各30min,再放入95%、100%各2次,每次20min。等量纯酒精和二甲苯制成混合液,将组织块浸润混合液,每次15分钟,共两次。放入二甲苯和石蜡的等量混合液,15分钟后取出。用加热的镊子夹取组织切片,切面向下放入包埋盒,轻轻导入溶解的石蜡。将已经固定和修剪好的石蜡块放在切片机的夹物台上,切取蜡带。将切取的蜡带放入60℃的水浴锅进行脱蜡复水,然后放入苏木精中染色30分钟,自来水冲洗15分钟直至切片变蓝。将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色2秒至数秒直至切片变红颜色较浅。然后再放入自来水中漂洗使切片变为蓝色。依次用50%、70%、80%酒精脱色各3到5分钟。用0.5%的伊红乙醇液对比染色1到3分钟。再进行脱水透明处理即得到HE切片。置于光学显微镜下观察。4.肺组织浸润的中性粒细胞计数其余小鼠肺组织剪碎,放入用1×HBSS溶液配置的0.5%的胶原酶中,置于37℃的水浴锅中对肺组织中的胶原组织等进行消化,期间每3分钟轻轻转动一下离心管使肺组织和胶原酶消化液尽量接触完全。30分钟后立即将装有肺组织的离心管取出终止消化。在无菌条件下将消化过的肺组织研磨,用1640培养液轻轻冲洗使细胞通过筛网。离心机离心15分钟,倒去上清,35%percoll溶液重悬,再离心收集得到沉淀的细胞,利用红细胞裂解液裂解红细胞3分钟,离心得到的沉淀再用PBS溶液重悬等步骤后得到肺组织原代细胞混合液,取一部分混合液,流式细胞抗体CD11b及Ly6G标记,流式法检测CD11b及Ly6G双阳性细胞在总细胞中所占比例,即为肺组织中性粒细胞浸润百分比。5.磁珠分选得到小鼠肺微血管内皮细胞剩余细胞混液在细胞计数板上计数,利用PBS溶液将其浓度调成1-5 ×108,每次仅取1ml进行细胞分离。每毫升细胞混悬液加入10μl的FCR进行封闭,再加PE-CD45抗体1μg,冰浴15分钟。然后加入PE cocktail 100μl,混匀常温孵育15分钟。加入磁珠前反复轻轻用吹打5次,然后加磁珠50μl,混匀,常温静置10分钟。加入含0.5%的BSA溶液至2.5ml,轻轻吹打2-3次。放入磁铁,静置5分钟。将液体轻轻倒入另一个无菌的离心管,即为CD45阴性细胞,收集附壁细胞即为CD45阳性细胞。将得到的CD45阴性细胞,再用APC-CD31阳性抗体重复上述步骤即得到小鼠肺微血管内皮细胞。6.小鼠肺微血管内皮细胞mRNA检测用PE-CD45、PE-CD31抗体标记,磁珠分选方法得到CD45-及CD31+细胞即为小鼠肺微血管内皮细胞,取一部分分离得到的微血管内皮细胞,计数,然后取约5×106细胞,加入1ml Buffer RLT,反复吹打几次,使样本充分裂解,常温放置5分钟。加入200μl氯仿,剧烈震荡15秒,常温放置2分钟。离心,将上层水相移到一个新的无RNA酶离心管,加入等体积70%乙醇,混匀,加入收集管的吸附柱中,向吸附柱中加入350 μl Buffeer RW1,离心,倒掉废液,再向吸附柱中加入80μl DNA酶Ⅰ混合液,室温孵育15分钟,加入350 μl Buffer RW1,离心,弃废液,向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2,离心,弃废液,再次重复一下Buffer RW2步骤,然后离心,弃废液,室温晾干15分钟,将吸附柱放入另一个无RNA酶的离心管,向吸附柱中加入40μ 1无RNA酶水,室温静置1分钟,离心,收集RNA溶液。逆转录后利用Real-time PCR方法检测HuR及ICAM-1的mRNA表达量。7.小鼠肺微血管内皮细胞蛋白检测分离得到小鼠肺微血管内皮细胞及分离出小鼠肺微血管内皮细胞后剩余的肺组织细胞混合液(CD45+和CD31-细胞),利用北京碧云天公司蛋白抽提试剂盒和细胞浆、细胞核蛋白抽提试剂盒提取细胞总蛋白、细胞浆蛋白和细胞核蛋白,免疫印迹(Western blot)检测MK2、HuR及ICAM-1蛋白含量。8.免疫组化方法检测磷酸化MK2及ICAM-1表达为检测小鼠肺组织中磷酸化MK2及ICAM-1的表达,将新鲜获得的小鼠肺组织放入10%的福尔马林中固定,依照说明书流程制作小鼠肺组织免疫组化切片。结果1.小鼠ARDS模型的建立及阻断MK2后肺部炎症变化与对照组和LPS +MMI-0100组相比,LPS组小鼠肺组织湿干比显著升高(p<0.05),肺组织中性粒细胞计数显著升高(p<0.05)。小鼠肺组织HE切片(200X)显示:对照组小鼠肺组织未见明显异常;LPS组小鼠腹腔注射LPS24小时后,发现该组肺组织结构遭到严重破坏,出现较严重的间质水肿,同时出现较多的中性粒细胞浸润;LPS + MMI-0100组小鼠肺组织间质水肿和中性粒细胞浸润明显减轻。2.小鼠肺微血管内皮细胞中mRNA表达检测提取分离得到的肺微血管内皮细胞中的mRNA,逆转录后利用Real-time PCR方法检测HuR及ICAM-1的mRNA表达量,对照组、LPS组和LPS + MMI-0100组小鼠肺微血管内皮细胞中HuR的mRNA无显著差别(p>0.05);与对照组相比,LPS组中ICAM-1的mRNA表达显著升高,而给予MMI-0100处理后,ICAM-1的mRNA表达显著减少(P<0.05)。3.Western blot方法检测MK2、HuR及ICAM-1蛋白表达量小鼠肺组织微血管内皮细胞中,对照组和LPS组小鼠肺微血管内皮细胞内总MK2(T-MK2)无明显变化,LPS + MMI-0100组小鼠肺微血管内皮细胞内总MK2表达有轻微下降。LPS组小鼠肺微血管内皮细胞内磷酸化的MK2(p-MK2)较对照组明显增加,经MMI-0100抑制剂处理后,磷酸化MK2表达量明显减少;三组小鼠肺微血管内皮细胞内总HuR(T-HuR)和细胞核HuR(N-HuR)无明显差别,但LPS组小鼠肺微血管内皮细胞的胞浆HuR(C-HuR)较其他两组明显增加,对照组和LPS +MMI-0100组C-HuR表达量无明显差别;LPS刺激后,总ICAM-1表达量及肺微血管内皮细胞表面ICAM-1表达量均明显上调(p<0.05),对照组和LPS + MMI-0100组小鼠肺微血管内皮细胞ICAM-1表达无明显差异。在肺微血管内皮细胞以外的肺组织细胞中,MK2在LPS +MMI-0100组小鼠肺组织表达量轻微下调,在对照组及LPS组小鼠体内表达无明显差异,HuR及ICAM-1蛋白表达量在三组无明显差异。4.免疫组化方法检测p-MK2及ICAM-1蛋白表达量三组小鼠肺组织免疫组化切片显示,LPS组较对照组p-MK2表达量显著增多,LPS + MMI-0100组小鼠肺组织p-MK2明显减少;ICAM-1在LPS组表达量较对照组和LPS + MMI-0100组明显升高。结论1.LPS导致的ARDS中,内皮细胞MK2-HuR通路被活化,MK2磷酸化增加及HuR发生核质转移。2.LPS导致的ARDS中,ICAM-1表达异常增加,且主要由小鼠肺微血管内皮细胞过度表达ICAM-1。由此显示,内皮细胞在肺ARDS炎症反应中起主导作用。3.当采用MK2抑制剂成功抑制MK2表达后,LPS刺激时,小鼠肺微血管内皮细胞HuR的核质转移的量减少,导致细胞浆内HuR蛋白表达量减少,ICAM-1表达量也相应减少,小鼠各项ARDS严重程度减轻。提示MK2/HuR通路可以通过调节HuR进出细胞浆的量来影响ICAM-1的表达量,进而对ARDS的严重程度产生影响。