目的:研究证实，藏药蕨麻具有提高机体免疫力、抗氧化、耐缺氧、抗疲劳等广泛生物活性。本课题组前期通过对蕨麻进行化学成分研究及药理活性跟踪发现，野蔷薇苷（Rosamultin）是蕨麻抗缺血、缺氧的活性成分。但目前关于野蔷薇苷(Rosamultin)抗缺血、缺氧作用的信号调控机制尚不清楚。因此，本工作在文献报道及前期研究的基础上，以人脐静脉内皮细胞株EA.hy926为研究对象，建立血管内皮细胞的缺氧性损伤模型，观察野蔷薇苷对缺氧诱导血管内皮细胞钙超载及凋亡的抑制作用，并通过分析钙超载、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号通路调控机制及线粒体凋亡通路，探讨野蔷薇苷抗缺氧诱导血管内皮细胞钙超载及凋亡的分子机制。　　方法:　　1药物浓度的确定　　1.1取对数生长期的EA.hy926内皮细胞，随机分为正常对照组，缺氧模型组，以及Rosamultin(1×10-6～1×10-14mol/L)处理组，通过MTT法、LDH活性检测，观察Rosamultin对EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用，确定实验中Rosamultin的药物浓度。　　1.2取对数生长期的EA.hy926内皮细胞，随机分为正常对照组，缺氧模型组，以及Verapamil(1×10-6～1×10-14mol/L)处理组，通过MTT法观察Verapamil对EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用，确定阳性对照药的给药浓度。　　2 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用　　2.1采用流式细胞技术，检测各组EA.hy926内皮细胞的活性氧(ROS)水平，观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞氧化损伤的影响。　　2.2通过倒置相差显微镜、HE染色，观察Rosamultin对缺氧条件下EA.hy926内皮细胞形态变化的影响。　　2.3通过台盼蓝染色观察Rosamultin对缺氧条件下EA.hy926内皮细胞存活率的影响　　3 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞钙超载的抑制作用　　3.1通过荧光酶标仪，检测各实验组EA.hy926内皮细胞中的钙离子浓度，观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞钙超载的影响。　　3.2通过激光共聚焦技术，观察Rosamultin对缺氧诱导EA.hy926内皮细胞钙超载的影响。　　3.3通过免疫印迹(Western Blot)技术，检测各组EA.hy926内皮细胞Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表达水平。　　4 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞凋亡的抑制作用　　4.1通过Hochest/PI双染、DAPI染色，从形态上观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的影响。　　4.2通过流式细胞术（AnnexinⅤ/PI双染法），检测各组EA.hy926内皮细胞的凋亡率，观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的影响。　　4.3通过免疫印迹(Western Blot)技术，检测各组EA.hy926内皮细胞Bax/Bcl-2、Cytc、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达水平。　　5采用免疫荧光法，观察各组EA.hy926内皮细胞中HIF-1α的核转位情况，探讨Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞HIF-1α活化的影响。　　6通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA），检测各组EA.hy926内皮细胞eNOS以及iNOS的表达水平。采用酶检测试剂盒检测各组EA.hy926内皮细胞NO水平。　　7通过免疫印迹(Western Blot)技术，检测各组EA.hy926内皮细胞pVHL、HIF-1α、HIF-1β、VEGH蛋白的表达水平。　　8通过缺氧前加入HIF-1α特异性抑制剂“二甲氧基雌二醇”(2Methoxyestradiol)，观察Rosamultin抑制缺氧诱导EA.hy926内皮细胞凋亡的分子机制。　　结果:　　1药物浓度的确定　　1.1 Rosamultin浓度的确定　　与正常对照组相比，缺氧模型组细胞活力显著下降，1×10-6 mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin处理之后，缺氧条件下细胞活力均显著上升(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L时其保护作用最显著，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范围内其作用随浓度降低而趋势。　　与正常对照组相比，缺氧模型组LDH外漏显著增高，加入1×10-6mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin处理均可是缺氧导致的内皮细胞LDH外漏减少(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L时，LDH外漏最少，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范围内，LDH外漏量随浓度降低而升高。　　综合MTT及LDH检测结果，确定Rosamultin的高中低浓度分别为1×10-11 mol/L、1×10-12 mol/L、1×10-13 mol/L。　　1.2 Verapamil浓度的确定　　与正常对照组相比，缺氧模型组细胞活力显著下降，各浓度Verapamil均能在缺氧条件下显著提高细胞活力(P＜0.01)。为了与Rosamultin浓度一致，选取1×10-11 mol/L为Verapamil浓度。　　2 Rosamultin对内皮细胞缺氧损伤的保护作用　　2.1细胞内ROS测定结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组细胞内ROS水平明显提高(P＜0.01)，野蔷薇苷各浓度组（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L）均能够明显减少缺氧引起的细胞内ROS堆积，降低细胞内ROS的水平(P＜0.01)。　　2.2细胞形态学检查　　与正常对照组相比，缺氧模型组细胞皱缩、脱落。Rosamultin处理组和阳性药组细胞形态明显改善。　　2.3台盼蓝染色结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组蓝染细胞显著增加，细胞存活率下降，而Rosamultin及Verapamil处理组蓝染细胞显著减少，细胞存活率显著升高(P＜0.01)。　　3 Rosamultin对缺氧所致EA.hy926内皮细胞钙超载的影响　　3.1荧光酶标仪检测结果　　与正常组相比，细胞内钙离子浓度随着缺氧时间延长而升高，呈时间依赖性。缺氧2h时，与缺氧损伤组相比，Rosamultin及Verapamil处理之后，细胞内钙离子浓度显著降低(P＜0.01)。　　3.2激光共聚焦检测结果　　细胞内钙离子浓度随着缺氧时间延长而升高，Rosamultin处理之后，细胞中荧光强度显著减弱。　　3.3钙离子通道及钙蛋白酶Western Blot检测结果　　细胞内Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表达量随着缺氧时间延长而增高(P＜0.01)，呈浓度依赖性;缺氧2h后，与正常对照组相比，缺氧模型组细胞内Stim1、Orai1、Calpain1均显著上升(P＜0.01)，Rosamultin处理之后Stim1、Orai1、Calpain1的表达水平均显著下降(P＜0.01)。　　4 Rosamultin对缺氧所致EA.hy926内皮细胞凋亡的影响　　4.1 Hochest/PI双染结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组中死亡细胞明显增多，视野中出现大量被红色荧光标记的细胞，染色质凝集增多，而Rosamultin处理之后，死亡细胞明显减少，染色质凝集减弱。　　4.2 DAPI染色结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组细胞核皱缩，着色加深，能看到明显的棒状凋亡小体，有的细胞胞核膨胀，破碎，而Rosamultin处理后，胞核皱缩的状态明显好转。　　4.3流式细胞法（AnnexinⅤ/PI双染法）结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组中细胞凋亡率显著增加(P＜0.01)，加入野蔷薇苷（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L）和维拉帕米(Verapamil，1×10-11mol/L)干预之后，细胞凋亡率显著下降(P＜0.01)。　　4.4 Rosamultin对凋亡相关蛋白的影响　　与正常对照组相比，缺氧模型组中细胞内Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量明显增高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达水平降低(P＜0.01);在加入Rosamultin处理之后Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P＜0.01），Bcl-2表达增高(P＜0.01)。　　5细胞内iNOS、eNOS、NO检测　　5.1 ELISA法检测细胞外iNOS、eNOS含量　　与正常对照组相比，缺氧模型组中细胞内iNOS水平显著升高(P＜0.01)，eNOS水平显著降低(P＜0.01)。而经过各浓度Rosamultin以及Verapamil处理之后，iNOS的水平显著降低(P＜0.01)，eNOS的水平显著提高(P＜0.01)。　　5.2分光光度法检测细胞外NO含量　　与正常对照组相比，缺氧模型组中NO水平显著降低(P＜0.01)。而经过各浓度Rosamultin以及Verapamil处理之后，NO的水平显著提高(P＜0.01)。　　6免疫荧光法观察细胞内HIF-1α的核位移结果　　正常对照组，细胞内HIF-1α表达量很少，细胞中被FITC标记的HIF-1α蛋白极少，荧光微弱，缺氧后细胞内HIF-1α入核并在细胞中大量表达，荧光强度显著增强，加入Rosamultin处理之后，HIF-1α表达显著增加，荧光强度与缺氧组相比显著增强(P＜0.01)。　　7 Rosamultin对缺氧诱导因子(HIF)相关蛋白的作用　　与正常对照组相比，缺氧模型组HIF-1α和VEGF蛋白表达量明显增加(P＜0.01)，pVHL表达量减少(P＜0.01)，HIF-1β表达量无明显变化;加入Rosamultin处理之后HIF-1α、VEGF和pVHL蛋白表达量与缺氧模型组相比均显著增加(P＜0.01)，HIF-1β蛋白表达无明显变化。　　8加入HIF-1α特异性抑制剂二甲氧基雌二醇（2Methoxyestradiol，后面简称2ME2）实验结果:　　8.1 MTT、细胞凋亡染色及流式细胞检测结果　　与正常对照组相比，2ME2（10μg/L）+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组细胞活力明显低于Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组(P＜0.01)，但显著高于缺氧模型组和2ME2(10μg/L)+缺氧组(P＜0.01)，细胞凋亡染色及流式细胞检测凋亡均与MTT结果一致。　　8.2免疫印迹(Western Blot)结果　　与正常对照组相比，缺氧模型组HIF-1α、VEGF蛋白显著升高，2ME2（10μg/L）+缺氧组HIF-1α、VEGF蛋白表达明显降低(P＜0.01);2ME2(10μg/L)+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组与缺氧模型组相比HIF-1α、VEGF蛋白表达显著下调，但VEGF显著高于2ME2(10μg/L)+缺氧组(P＜0.01)。　　结论:　　1 Rosamultin能明显减轻缺氧诱导内皮细胞钙超载、凋亡，改善细胞形态，提高细胞存活率，对缺氧诱导的细胞损伤有明显的保护作用。　　2 Rosamultin可能是通过抑制钙池依赖性钙离子通道减轻内皮细胞缺氧性钙超载。　　3 Rosamultin可能通过抑制线粒体凋亡通路抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡。　　4 Rosamultin可通过缺氧诱导因子信号通路发挥对内皮细胞缺氧损伤的保护作用。