目的:预计到2040年,糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）将影响10%以上的世界人口数。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy,DCM）可引起心脏扩大、心肌收缩力下降,从而造成心力衰竭,是DM患者死亡的主要原因之一。DCM是全球心力衰竭的重要病因,对全国医疗费用支出造成沉重的负担。在DM患者中,心血管相关并发症是其主要的死亡原因。DCM的病理生理学改变复杂,与心脏暴露在高血糖环境以及心肌细胞中脂肪酸堆积和细胞因子释放密切相关。高血糖会增强心肌细胞蛋白质的葡糖酰胺修饰,造成不可逆的心肌损伤。同时,高糖会导致晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）的产生增多,而AGEs的蓄积进一步加重心肌损伤。此外,DM自主神经病变与高血糖密切相关。高脂质水平（包括脂肪酸（Fatty acid,FA）和甘油三酯）会导致心肌细胞中脂肪滴积累增加,从而介导心脏脂毒性。胰岛素信号减弱是T1DM和T2DM的标志,它的改变导致了其他信号通路发生级联反应,包括蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）信号增强和AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）信号减少,导致心脏结构与功能发生改变。DCM早期表现为孤立的舒张功能障碍,但随着时间的推移,逐步发展为以各种代谢和神经体液途径紊乱为特征的收缩功能障碍。在T2DM相关的DCM中,冠状动脉微血管炎症和其对心肌细胞和内皮细胞的旁分泌作用介导了左心室向心性重塑和肥厚,增加心室僵硬度,进而引起心脏舒张功能障碍。神经氨酸酶（Neuraminidase,NEUs）是一类能切割细胞表面唾液酸的酶家族。NEUs作为调节唾液酸化状态的关键酶,不仅在感染性疾病中发挥着重要作用,而且在其他类型的疾病中也起着关键作用。NEU1参与调节体内各种细胞代谢行为和信号传递,并影响相关疾病的发展,如心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、血液系统疾病和癌症。单核细胞和巨噬细胞中NEU1高表达,可导致动脉粥样硬化的发展和加剧斑块炎症。NEU1的下调可使极低密度脂蛋白减少,减轻动脉粥样硬化。关于NEU1在心肌细胞中的作用的研究很少。此外,与健康对照组相比,心肌梗死患者血浆中NEUs活性较高。对于心肌细胞,细胞膜的异常唾液酸化或去唾液酸化会导致心脏离子通道功能紊乱,致使导致心律失常的发生。NEU1与心血管疾病的发生发展密切相关。本研究旨在建立小鼠DCM模型及评价标准,探索NEU1对DCM产生的作用,以及在体内与体外实验中探究NEU1的机制,设计逆转实验验证NEU1对DCM的具体作用机制。方法:第一部分:动物实验:选用8-10周龄（体重20-25g）无菌雄性C57BL/6J小鼠,前期预实验小鼠分组为对照组和链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）组,STZ组按照50mg/kg/d的剂量腹腔注射STZ,持续5天。对照组注射同等体积、相同天数的柠檬酸缓冲液。第16周进行取材。免疫印迹法、酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和免疫荧光染色+麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）染色共定位和检测NEU1在两组小鼠心脏组织的表达变化和定位情况。第二种动物实验分组:选用8-10周龄（体重20-25g）无菌雄性C57BL/6J小鼠,心肌原位注射腺相关病毒（AAV9-sh RNA或AAV9-sh NEU1）,四周后,进行STZ或者柠檬酸缓冲液的注射构建糖尿病心肌病模型。特定时间点应用心脏超声和血流动力学监测和分析各组小鼠心功能变化,随后进行病理学和分子生物学组织取材。免疫印迹检测AAV-sh NEU1转染效率。心脏组织PSR染色、RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）技术、免疫印迹法和针对α-SMA免疫荧光染色检测纤维化水平;免疫印迹、RT-PCR和心脏组织免疫组化染色检测心脏组织炎症因子水平和炎性细胞浸润情况;凋亡荧光染色探针（Terminal deoxynucleotide transferase-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）染色、免疫组化染色和免疫印迹检测各组小鼠心脏组织细胞凋亡水平;免疫印迹法检测p67phox和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）蛋白表达水平,相应的ELISA试剂盒检测心肌组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）氧化型谷胱甘肽（Glutathione（Oxidized）,GSSG）含量、SOD活性和4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal,4-HNE）,RT-PCR检测心肌组织NADPH氧化酶亚基的m RNA水平。细胞实验:分离SD大鼠乳鼠心脏并提取原代大鼠心室肌细胞（Neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs）,使用含15%FBS的培养基培养NRVMs 24h,然后换用无血清的低糖培养基;根据实验设计将细胞接种于6孔板或24孔板。24孔板分为两组:PBS组使用葡萄糖浓度5.5m M的培养基培养24h,HG组使用葡萄糖浓度为33m M的培养基培养,时间同PBS组。随后进行针对NEU1的细胞免疫荧光染色。6孔板分为4组:PBS组同前所述;随着高糖培养基培养时间的不同分为HG 6h组;HG 12h组;HG 24h组。随后提取细胞蛋白并使用免疫印迹法检测细胞NEU1蛋白在不同时间点的表达情况。使用三种AAV9-shNEU1（即AAV9-shNEU1#1,#2,#3）转染NRVMs,使用RT-PCR检测细胞NEU1 m RNA水平。第二部分:细胞实验:根据实验需要,如下分组方法。第一种分组应用到了小干扰RNA沉默SIRT3以验证SIRT3的作用:PBS组;sh NEU1组;HG组;HG+sh NEU1组;si SIRT3组;si SIRT3+sh NEU1组;si SIRT3+HG组;si SIRT3+sh NEU1+HG组。利用免疫印迹检测si SIRT3的转染效率。对各组细胞检测ROS水平,提取各组细胞RNA进行RT-PCR检测gp91、p67、p22、BAX、BCL-2、IL-6、TNF-α和MCP-1基因的m RNA水平,Cell count analysis（CCK-8）检测各组细胞活力水平。ELISA试剂盒检测细胞MDA水平和SOD活性。第二种分组应用到H2O2来诱导细胞细胞死亡:PBS组;sh NEU1组;H2O2组;H2O2+sh NEU1组;si SIRT3组;si SIRT3+sh NEU1组;si SIRT3+H2O2组;si SIRT3+sh NEU1+H2O2组。各组细胞活力水平使用CCK-8来检测。第三种分组应用到小干扰RNA沉默AMPKα以验证AMPKα的作用:HG组:HG+sh NEU1组;HG+si AMPKα组;HG+sh NEU1+si AMPKα组。利用免疫印迹检测si AMPKα的转染效率和AMPKα抑制后对SIRT3和SOD2蛋白的表达影响。对各组细胞检测细胞ROS水平,提取各组细胞RNA进行RT-PCR检测IL-6、TNF-α基因的m RNA水平,ELISA试剂盒检测细胞SOD活性,CCK-8试剂盒检测各组细胞活力水平。第四种分组应用到AMPKα上游三种激动剂的抑制物(即Takinib（一种有效且选择性的TGF-β活化激酶1（transforming growth-factor-β-activated kinase-1,TAK1）抑制剂）、STO-609（一种选择性Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β（Ca2+/calmodulin dependent protein kinases,Ca MKKβ）抑制剂）和肝激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）的小干扰RNA（si LKB1）:PBS组;HG组;HG+sh NEU1组;HG+sh NEU1+si LKB1组;HG+sh NEU1+STO-609组;HG+sh NEU1+Takinib组;免疫印迹法检测各种抑制剂对AMPKα的激活水平和SIRT3、SOD2蛋白的表达影响。CCK-8检测各组细胞活力水平。动物实验:选用8-10周龄（体重20-25g）的SPF级C57BL/6J雄性小鼠和AMPKα-KO的雄性小鼠,分组如下:WT+Saline+sh RNA组;WT+Saline+sh NEU1组;WT+STZ+sh RNA组;WT+STZ+sh NEU1组;KO+Saline+sh RNA组;KO+Saline+sh NEU1组;KO+STZ+sh RNA组;KO+STZ+sh NEU1组。利用超声和血流动力学检测小鼠心脏功能,使用RT-PCR检测各组小鼠心脏组织的TGF-β、COL 1、IL-6、TNF-α、BAX和BCL-2的基因表达水平。结果:第一部分:免疫印迹结果表明,NEU1在DM小鼠的心脏中显著增加,ELISA结果表明STZ处理激活了小鼠心脏中NEU1的表达,免疫荧光染色和WGA染色共定位表明,NEU1主要定位于心肌细胞。HG刺激NRVMs的免疫印迹结果表明,NEU1的表达随HG刺激的时间延长而上调,且免疫荧光染色也证明NEU1在HG环境中表达显著上调。使用了三种AAV9-shNEU1转染NRVMs,发现#2 AAV9-shNEU1抑制NEU1m RNA水平最显著,所以之后的研究均用#2 AAV9-sh NEU1。检测心肌组织的NEU1表达情况发现,sh NEU1的转染显著降低了心脏NEU1蛋白的表达。STZ诱导DM后,小鼠的血糖水平、胰岛素含量、Hb A1c和体重均呈现不同程度的改变,但是抑制NEU1的表达并未显著改善上述指标。DM组小鼠的左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）显著降低以及左室舒张末期直径（LVEDD）显著增加,NEU1的抑制改善了心功能的恶化。此外,NEU1抑制改善DM状态下心脏的±dp/dt和E/A值。PSR染色、免疫荧光染色和RT-PCR结果发现,DM状态下小鼠心脏组织纤维化水平显著升高,而sh NEU1的处理可显著降低STZ导致的小鼠心脏纤维化水平。STZ的处理显著增加p65和IκBα的磷酸化水平,且使IκBα的降解增多,但sh NEU1的处理可显著下调p65和IκBα的磷酸化水平。RT-PCR结果表明,DM状态下心肌组织的各种炎症因子基因m RNA水平显著升高,但NEU1的抑制可下调这些基因的m RNA水平。免疫组化染色结果表明,DCM的炎症细胞浸润显著增加,而sh NEU1可显著减轻炎症细胞的迁移和浸润。Tunel染色结果表明,DCM心肌组织的Tunel阳性信号显著增多,sh NEU1可显著减少Tunel阳性信号。免疫组化染色表明,敲低NEU1可显著抑制DM状态下心肌组织c-caspase3的表达,免疫印迹结果进一步表明,NEU1的敲低可显著提高STZ诱导的心肌组织BCL-2蛋白的表达,和下调BAX和c-caspase3的蛋白表达。免疫印迹结果发现,DM组的p67phox蛋白表达水平显著升高,相对应的SOD2的蛋白表达显著降低,sh NEU1可逆转上述两种蛋白的表达。DM状态下的GSH水平显著降低,且心肌组织中GSSG显著升高,sh NEU1可升高STZ导致的GSH降低,降低STZ导致的GSSG升高。DM组心肌组织SOD活性显著下降,sh NEU1可以提升DCM心脏组织中SOD的活性。此外,sh NEU1也可显著降低脂质过氧化物的水平。PCR结果表明,sh NEU1降低了STZ注射诱导的DM小鼠心肌组织中p67phox、p22phox和gp91phox m RNA的上调。第二部分:免疫印迹和PCR结果表明,DM的心肌组织中的的SIRT3的m RNA和蛋白质表达水平显著降低,而sh NEU1可提高DM状态下心肌组织的SIRT3的m RNA和蛋白质表达水平。体外试验中,高糖刺激引起NRVMs ROS水平升高,以及gp91、p67 phox和p22 phox m RNA水平的显著升高,sh NEU1的处理显著降低了高糖刺激引起的氧化应激水平的升高,但在使用si SIRT3转染细胞组,sh NEU1对高糖导致的ROS的生成的抑制作用减弱,且不能显著降低gp91、p67 phox和p22 phox等m RNA的水平。此外,高糖刺激可导致NRVMs细胞的炎症因子表达升高,如HG组的IL-6、TNF-α和MCP-1 m RNA水平显著升高,但在使用si SIRT3后,sh NEU1处理并不能降低HG引起的IL-6、TNF-α和MCP-1 m RNA水平的升高。HG刺激24小时,NRVMs的细胞活力显著下降,而NEU1抑制可显著改善HG环境下的细胞活力,但应用si SIRT3后,sh NEU1失去了提高细胞活力的作用。HG刺激下调NRVMs细胞中BCL-2 m RNA水平和上调BAX的m RNA水平。然而,NEU1抑制可逆转这些不利的改变,但是,NEU1敲低的保护细胞免受HG刺激引起的细胞凋亡作用被SIRT3沉默所消除。同时,SIRT3沉默完全消除了sh NEU1对H2O2诱导的细胞凋亡的保护。sh NEU1处理可显著下调HG导致的MDA高水平和上调HG引起的SOD活性下降,但,沉默SIRT3使sh NEU1失去了对HG刺激的NRVMs脂质过氧化和氧化损伤的有益作用。免疫印迹结果发现,shNEU1处理恢复了由HG介导的心肌细胞中AMPKα磷酸化水平降低。使用sh AMPKα后,AMPKα的表达水平大概下调了8倍。蛋白质印迹结果显示,未使用sh AMPKα时,sh NEU1的处理可上调SIRT3和SOD2的蛋白表达水平,然而,在给予sh AMPKα处理后,sh NEU1的处理并不能提高HG导致的SIRT3和SOD2蛋白表达水平的下调。与SIRT3的下调一致,使用sh AMPKα后,NEU1抑制不能显著抑制HG导致的ROS和SOD活性的改变。对照组sh RNA中,NEU1抑制可显著降低HG导致的IL-6、TNF-αm RNA的高表达水平,并提高细胞活力,但sh AMPKα阻断了sh NEU1对心肌细胞的保护作用。AMPKα-KO小鼠STZ+Vehicle组和STZ+shNEU1组两组间的LVEF和LVFS无统计学差异。在AMPKα-KO小鼠中,sh NEU1不能显著下调DCM心肌组织中的的TGF-β和col I m RNA水平。在AMPKα-KO小鼠中,sh NEU1的处理不能显著下调DCM心肌组织中的TNF-α和IL-6等炎症因子m RNA水平。在AMPKα-KO小鼠中,NEU1抑制并不能显著调控BAX和BCL-2的m RNA的表达。免疫印迹结果表明,添加si LKB1组的AMPKα的磷酸化水平显著降低,而添加Takinib组和STO-609组的AMPKα的磷酸化水平相对于HG+sh NEU1组无显著性变化,但与添加si LKB1组的AMPKα磷酸化水平有显著性差异;在敲低LKB1后,sh NEU1处理组,SIRT3和SOD2的蛋白表达水平没有增加。此外,添加Takinb组和添加STO-609组的SIRT3和SOD2的蛋白与HG+sh NEU1组无显著差异,但与添加si LKB1组有显著性差异。此外,检测细胞活力发现,添加si LKB1后,sh NEU1不能对HG诱导的细胞活力下降起到提高作用,而添加Takinb和STO-609后,sh NEU1处理仍可提高HG环境下的细胞活力。结论:1.NEU1在DCM中表达显著升高,且主要定位于心肌细胞。2.NEU1缺失可显著改善DM状态下的心脏功能障碍和心肌组织的纤维化水平、炎症、细胞凋亡和氧化应激水平。3.NEU1缺失可能是通过LKB1激活AMPK-SIRT3信号通路,进而改善心肌组织或心肌细胞的病理状态。