第一部分IF1通过抑制线粒体稳态调节β细胞的胰岛素分泌功能研究背景:线粒体功能对于调节胰腺β细胞的胰岛素分泌具有十分重要的意义。IF1（ATP synthase inhibitory factor subunit 1）是一种天然的线粒体内调节蛋白,通过结合线粒体呼吸链F1F0-ATP合酶,抑制F1F0-ATP合酶的ATP水解活性。IF1也可能参与并维持F1F0-ATP合酶多聚体和线粒体内膜嵴的结构的形成。既往研究结果提示,在不同类型的组织细胞的体内实验中,IF1蛋白可能对线粒体功能表现出不同的生物学调节机制。IF1蛋白在β细胞的体内实验中具体有什么样的生物学调节功能,以及IF1蛋白对胰岛β细胞线粒体的调节机制具体可能是什么,这些问题尚需进一步探究。研究方法:首先构建了全身IF1敲除和过表达的C57/B6J小鼠,检测了正常条件下小鼠体内的胰岛素分泌水平,胰岛素囊泡的组成和β细胞容量,通过电子显微镜分析了线粒体在微观层面上结构的变化。分离了小鼠体内的胰岛组织并培养,检测了IF1敲除和过表达后相应胰岛组织的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能的变化。通过western blot方法分析了IF1敲除和过表达后相应胰岛组织中线粒体呼吸链F1F0-ATP合酶蛋白亚单位的表达变化。另外在β细胞系INS-1细胞中,分别敲减和过表达了IF1蛋白。分析了IF1蛋白敲减和过表达后相应线粒体结构稳态的变化情况,同时还分析了线粒体的氧化磷酸化功能变化。检测了IF1敲除和过表达对线粒体膜电位、细胞内ATP总含量、乳酸释放、ROS水平等的影响和改变。研究结果:全身IF1敲除和过表达的小鼠个体从出生到10个月,未能看到相应小鼠相比野生型小鼠有明显的表型差异。但是在分离的胰岛组织中,过表达IF1抑制了胰岛组织的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能,而敲除IF1则促进了相应的葡萄糖刺激胰岛素的分泌功能。IF1过表达降低了小鼠体内血液中的胰岛素水平。敲除IF1增加了小鼠体内β细胞中具有致密核心的胰岛素囊泡的比例。IF1敲除和过表达没有对小鼠体内β细胞的线粒体膜结构有明显影响,但是IF1敲除增加了小鼠体内β细胞中的线粒体总容积（Mitochondrial mass）。IF1敲减和过表达分别促进和抑制了INS-1细胞的氧化磷酸化功能和细胞内ATP总含量,降低和增加了乳酸释放的速率。IF1的敲减促进了线粒体网络结构（Mitochondrial network）的维持,降低了线粒体膜电位,减少了细胞整体的和线粒体内的ROS的生成水平,而过表达IF1则提高了INS-1细胞内线粒体膜电位水平,增加了ROS的生成水平。研究结论:正常条件下,IF1蛋白对β细胞的线粒体呼吸功能具有抑制作用,并间接的抑制了线粒体稳态。IF1蛋白负向调节β细胞内ATP含量和胰腺组织内β细胞的胰岛素合成和分泌功能。第二部分OSCP蛋白通过促进线粒体呼吸改善糖尿病鼠血糖水平研究背景:线粒体呼吸功能对β细胞内ATP的合成和胰岛素的分泌具有重要的意义。OSCP（Oligomycin sensitivity conferral protein）是位于线粒体呼吸链的、参与组成F1F0-ATP合酶复合体的一种亚单位蛋白。OSCP是连接F1F0-ATP合酶复合体中侧臂蛋白与F1亚单位蛋白,维持F1F0-ATP合酶复合体的正常结构的关键蛋白分子。OSCP也可能参与对线粒体膜通透性转变的调节。研究表明,OSCP蛋白在小鼠心力衰竭模型的心肌细胞中表达降低,而过表达OSCP蛋白可以改善心力衰竭小鼠的心功能。糖尿病时胰腺组织β细胞内线粒体氧化磷酸化相关蛋白表达下降,OSCP蛋白对β细胞的调节功能还没有相关的研究。通过纠正和增加β细胞内OSCP蛋白的表达水平,能否有利于降低糖尿病中血液葡萄糖浓度值得进一步的探索。研究方法:在心肌细胞的线粒体内过表达OSCP,观察OSCP蛋白增加对线粒体呼吸功能和氧化磷酸化功能的影响。通过线粒体肿胀实验检测了过表达OSCP蛋白对线粒体膜通透性转变的影响。由于线粒体功能与β细胞胰岛素分泌密切相关,为了说明OSCP蛋白对β细胞的功能调节作用,这里建立了STZ糖尿病小鼠模型,通过western blot方法和免疫组织化学染色的方法检测了OSCP蛋白在STZ的糖尿病小鼠胰岛组织内的表达水平变化。通过在AAV病毒表达载体中添加insulin II的启动子,构建和包装了可以在β细胞内特异性的过表达的病毒颗粒。通过AAV病毒腹腔注射感染STZ糖尿病小鼠,观察过表达OSCP后糖尿病小鼠的病毒表达情况和血液葡萄糖浓度的变化。研究结果:增加线粒体内OSCP蛋白水平可以提高线粒体的呼吸功能,提高线粒体呼吸相关的ATP合成效率。线粒体肿胀实验也表明,OSCP蛋白过表达可以显著的提高线粒体对钙离子诱导的膜通透性转变的耐受性。相比正常对照组小鼠,STZ糖尿病小鼠的胰岛组织内OSCP蛋白的表达水平明显降低,在更多的糖尿病小鼠模型中,相关的研究结果均显示糖尿病条件下胰岛组织内OSCP蛋白减少。通过AAV病毒感染小鼠,外源性的在β细胞内过表达OSCP蛋白可以降低STZ糖尿病小鼠的葡萄糖耐量血糖水平和糖化血红蛋白浓度。研究结论:在糖尿病的胰岛组织内OSCP蛋白表达减少,纠正OSCP蛋白的表达水平则可以改善糖尿病的葡萄糖耐量和糖化血红蛋白的异常。这一方面可能与OSCP蛋白促进了β细胞线粒体呼吸功能和ATP的合成有关,另一方面也可能与OSCP蛋白使糖尿病中β细胞内线粒体对膜通透性转变的耐受性提高有关。第三部分ES1蛋白通过提高线粒体氧化磷酸化促进β细胞胰岛素分泌研究背景:线粒体功能对β细胞内ATP的合成和调节胰岛素的分泌具有重要的意义。ES1是定位于线粒体内的、一种具体生物学功能尚不清楚的蛋白分子。既往在斑马鱼模型的研究结果表明,ES1蛋白可能特异性的在视网膜感光细胞中表达分布,具有促进线粒体容积变大和提高感光细胞内ATP含量的作用。然而在另外的研究结果中,利用northern blot方法显示ES1的m RNA分子在人体不同的组织细胞内均可检测到,并且尤其在心肌和骨骼肌细胞中的表达水平较高。研究方法:在β细胞系INS-1细胞中过表达或敲减ES1蛋白,分别检测了线粒体呼吸功能的变化。通过western blot方法和免疫组织化学染色的方法检测了ES1蛋白在正常小鼠和多种不同的糖尿病模型的小鼠胰腺组织内的表达和分布。通过在AAV病毒表达载体中添加insulin II的启动子,构建和包装了可以特异性的在β细胞过表达的病毒颗粒。通过AAV病毒感染STZ糖尿病小鼠,检测并记录了相应小鼠的葡萄糖耐量和糖化血红蛋白水平的变化。在体内和体外实验中分析了ES1过表达对β细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能的调节作用,并同时检测了STZ糖尿病小鼠的β细胞容量的变化情况。研究结果:正常条件下,ES1蛋白在胰腺组织细胞内广泛的表达分布,并且在胰腺β细胞内的表达水平尤其较高。在INS-1细胞中,过表达ES1显著的促进了线粒体的氧化磷酸化功能,而抑制ES1表达,则明显的降低了线粒体的氧化磷酸化功能。多种糖尿病小鼠模型中的研究结果均显示,相比正常小鼠,糖尿病小鼠胰岛组织β细胞内的ES1蛋白表达水平显著的降低。体内和体外实验结果显示,ES1蛋白过表达可以促进β细胞的胰岛素分泌功能。通过AAV病毒感染小鼠,外源性的在β细胞内过表达ES1蛋白,可以降低STZ糖尿病小鼠的葡萄糖耐量,空腹血糖水平和糖化血红蛋白浓度,提高STZ糖尿病小鼠血液中的胰岛素水平和体内的β细胞容量。研究结论:胰腺组织中β细胞具有较高的ES1蛋白表达水平。ES1蛋白对线粒体氧化磷酸化功能具有显著的正向调节功能。糖尿病可以抑制β细胞内ES1蛋白的表达水平。而在糖尿病小鼠的β细胞内过表达ES1蛋白可以促进胰岛β细胞的胰岛素分泌功能,这有助于改善相应糖尿病小鼠的血糖和保护糖尿病小鼠体内的β细胞容量。