山桐子性别相关分子标记的研究与开发

来源 :长江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ABC20090907
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山桐子为杨柳科雌雄异株高大乔木,是重要的木本经济油料植物,其实生苗童期长达4-5年,童期漫长,目前在生产上对雌株的经济需求明显大于雄株;山桐子在幼苗时期的性别很难区分,这使得山桐子的良种选育和遗传栽培利用等研究较难进行。因此,开发用于山桐子幼苗早期性别鉴定的技术,可以有效地缩短育种周期、节约育种成本,在生产和育种方面具有极其重要的意义。本研究首先利用PCR扩增技术,验证前人在山桐子中已报道的性别鉴定分子标记的通用性;进一步利用简化基因组测序的方法,开发了大量的SSR分子标记;优化了SRAP-PCR的反应体系,并筛选出了大量的SRAP分子标记;并根据公开的山桐子雌雄花表达谱数据库筛选差异基因,利用生物信息学分析筛选山桐子雌雄花特异的基因,并根据差异表达基因序列设计引物,通过PCR扩增进行验证。所得的研究结果如下:(1)利用已知性别的山桐子资源,对前人已报道的1个ISSR标记和1个SCAR标记进行通用性的验证;结果本研究中所用的两组标记均未表现出良好的通用性,因此有必要开发基于山桐子性别早期鉴定的分子标记。(2)以杨树基因组为参考基因组进行简化基因组测序,利用MISA软件对多态性SLAF标签进行SSR位点识别,并设计引物进行验证。对山桐子SLAF标签上SSR数量、SSR位点特征、SSR重复次数分布以及序列长度进行了分析,最终得出山桐子基因组中SSR数量最多的为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸。单核苷酸中A/T类型比例最高;二核苷酸和三核苷酸中以TA/AT和AAA,G,C,T四种碱基均可重复比例最高,78.52%的SSR长度主要在10-15 bp之间。随机合成的100对引物扩增多态性引物比例为35%,其中的STZ-SSR1对山桐子雌雄株的特异片段验证率达68.33%,将其转化为SCAR特异标记共有47份样品检测出差异条带,对其进行二次和三次重复实验检测在雌雄之间没有特异,最终该标记并非雌雄性别差异标记;随机选择6对多态性引物对30份山桐子样品进行遗传分析,聚类结果很好地反映出样品来源、地理分布和资源特征。(3)采用正交实验设计的方法,对山桐子SRAP反应体系进行优化,并利用该体系对846对引物组合进行扩增。结果得到了各因素对SRAP-PCR影响的排名,并确定了最优组合。经检测846对引物中有792对引物可在山桐子中扩增出条带;利用6对多态性引物组合,对24份山桐子资源进行PCR扩增,资源的亲缘关系聚类结果与前期利用SSR分子标记分析的结果高度一致。(4)基于转录组数据资源库,获得了大量基础数据,共组装得到104,732个Unigene基因,平均长度845bp。各数据库注释的Unigene数量分别为:51,531、21,025、26,669、34,860、32,302个;通过与NR数据库注释到数量最多的三个物种分别是毛果杨、美洲黑杨、银白杨,表明山桐子的亲缘关系与这三种物种较为接近。在对山桐子转录组进行SSR位点的搜索时,一共检索到14,785个SSR位点,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复类型最多,优势重复基元为A/T、TC/CT、ATA,G,C,T四种碱基均可;山桐子转录组SSR重复次数主要集中在8-24次之间,山桐子SSR长度主要在10-15 bp之间。通过对不同时期山桐子转录组数据进行对比,共检测出有267个雌花特异表达基因和170个雄花特异表达基因,设计合成特异引物在山桐子雌雄株之间进行PCR扩增,结果显示山桐子雌雄株在115对雄株特异基因引物和117对雌株特异基因引物中均未表现出特异性。
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