核苷类物质为重要抗病毒抗肿瘤药物的来源。许多核苷类药物,如齐多夫定、利巴韦林、拉米夫定、卡培他滨等均在临床上得到广泛应用。核苷类物质一般采用化学合成的方法,使用到大量有毒有害的试剂,给环境带来严重的污染。应用核苷磷酸化酶酶法合成核苷类物质,由于反应条件温和,反应过程简单,反应转化率高,为近年来研究的热点之一。本研究首先构建了三种核苷磷酸化酶单表达菌E.coli BL21(DE3) (pET-11a-deoD) (1)、E.coli BL21(DE3) (pET-11a- udp) (2)和E.coli BL21(DE3) (pET-11a-deoA) (3),并在此基础上首次构建了核苷磷酸化酶双表达菌,即双质粒表达菌(DAD(4)和DUD(5)),串联表达菌TDA(6)和TDU(7),均表现出良好的稳定性和较高的应用价值。将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶的基因分别克隆到pET载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构建1、2和3,经IPTG诱导3h后,均表达出大量可溶性的蛋白。经活力测定,完整细胞中的PNPase活力为116U/mg,UPase活力为3532U/mg, TPase活力为3550U/mg,分别比宿主菌提高了8.4倍、4.8倍和7.1倍。酶活力远高于常见的野生菌。三株重组菌在无抗性LB斜面上连续转接15次,质粒稳定性在90%以上。经研究发现,乳糖完全可以代替IPTG诱导上述重组工程菌表达大量酶蛋白。LB培养基中加入8mmol/L的乳糖所产生的效果与IPTG类似。在菌体培养过程中,乳糖不仅可以作为诱导剂来使用,而且其降解物葡萄糖和半乳糖还可作为碳源,具有一定的促进菌体的生长作用。由于很多核苷类化合物的合成为嘧啶和嘌呤之间的相互转换,需要1、2或1、3共同参与才能实现。因此本研究按照嘌呤核苷磷酸化酶+嘧啶核苷磷酸化酶的模式构建出共表达重组菌(双质粒表达菌(DAD(4)和DUD(5))、串联表达菌TDA(6)和TDU(7)),以达到使用单一工程菌即可实现嘌呤核苷与嘧啶核苷之间相互转化的目的。实验发现四株共表达重组菌均能大量表达相应的两种酶蛋白。经活力测定,均比宿主菌有大幅度上升。在非抗性LB斜面连续转接15次,质粒稳定性均在85%以上应用上述构建好的重组菌均可以高效地酶法合成核苷。以重组菌1、2、3合成核苷时,反应在1-2h左右达到最高转化率。由2和3催化的反应,随着反应时间的持续,新合成的产物又被磷酸化成核糖(脱氧核糖)-1-磷酸,而1参与的核苷转化反应却无此现象。反应温度在40-65℃之间都有一定的转化率；三个重组菌适宜的pH值范围都在7.0-7.5之间；由于目的蛋白的表达量很高,所以无需很多菌体量就能得到较高的转化率。与文献报道类似胞嘧啶类核苷无法采用核苷磷酸化酶来合成,而鸟嘌呤为核糖受体时,反应转化率很低。以三氮唑核苷和脱氧三氮唑核苷的合成为例,研究了双酶反应。50℃,pH7.0的缓冲液中,菌体量为0.4%(各0.2%),2h内即可实现较好的转化率。磷酸盐对反应的进行比较重要。鸟嘌呤难溶于水,鸟苷和脱氧鸟苷的合成转化率偏低；但是也由于这一特性,以鸟苷为核糖供体时,转化率反而明显上升。由嘌呤核苷转化为嘧啶核苷,转化率明显低于由嘧啶核苷转化为嘌呤核苷。以2,6-二氨基嘌呤核苷(DAPR)和2,6-二氨基嘌呤脱氧核苷(DAPdR)的合成为例,研究了共表达重组菌DAD、DUD、TDU和TDA酶法合成核苷。经实验研究,共表达的四种重组菌酶催化反应条件类似,最适反应条件为：缓冲体系为50mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.5),底物终浓度为30mmol/L,加入0.5%的湿菌体,50℃反应2h。在对其它核苷合成时的结果与双酶反应非常类似,鸟嘌呤不能转化成相应的核苷,且阿糖尿苷不能转化为阿糖腺苷,可能阿糖核苷不是大肠杆菌来源的核苷磷酸化酶的底物。