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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种寄主范围十分广泛的病原真菌，由其引起的菌核病是包括油菜在内的许多重要作物上的毁灭性的病害。核盘菌在侵染初期分泌小分子蛋白、草酸、细胞壁降解酶类杀死寄主细胞、抑制寄主的抗性，并从死亡的细胞中吸取营养，是典型的死体营养型真菌。目前尚未在油菜中发现高效的抗病品种，油菜菌核病始于子囊孢子在花瓣上侵染，并随罹病花瓣飘落至枝条和主茎，感染和杀死枝条或整个植株。由于田间油菜植株密、冠层厚，药剂难以抵达病菌为害部位，防治非常困难。核盘菌低毒相关DNA病毒1(Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1, SsHADV-1)是首例在真菌中发现的DNA病毒，该病毒侵染性强，病毒粒子可直接侵染核盘菌，也可以在不同的营养体亲和型菌株间进行传播，而且发现有昆虫传播介体，是极具生物防治潜力的真菌病毒。前期研究发现在盛花期喷施携带SsHADV-1的核盘菌菌丝片段可以高效控制菌核病并显著提高油菜产量，但是携带SsHADV-1的核盘菌能否在油菜上生长并不清楚；同时，携带低毒相关病毒的菌株能否在植物上长期存活是利用真菌病毒控制病害的关键。因此，本文主要研究携带SsHADV-1的核盘菌在油菜上的生存和生长及其机制、研究携带病毒的核盘菌对油菜生长发育的影响及其机制，以及基于本研究的新发现建立的应用SsHADV-1控制油菜菌核病的新技术。取得的主要结果如下。
1.携带SsHADV-1的核盘菌菌株DT-8可以在油菜上内生性生长，并在核盘菌群体中传播病毒。在油菜抽薹期喷施DT-8的菌丝片段，7周之后，在油菜成熟期的果荚上可以检测到病毒的DNA。为了确认携带核盘菌的菌株可以在油菜内或者表面生长，将菌株DT-8菌丝块接种到油菜叶片上，一周后未产生任何病斑，取距DT-8菌丝块约1cm位置的油菜叶片组织进行共聚焦荧光观察，发现菌株DT-8可以在油菜叶片表面蔓延生长，同时形成简易侵染垫的结构侵入油菜组织中吸取营养物质。表面消毒的油菜种子经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后，于MS平板上萌发，之后分别移至含有MS培养基的组织培养瓶和无菌培养土中，培养20d和30d。PCR检测证实在油菜的根、下胚轴和叶等部位均可检测到SsHADV-1的DNA和核盘菌的DNA，表明菌株DT-8可以在油菜上生长。利用菌株DT-8RFP(mCherry荧光蛋白标记的菌株DT-8)处理油菜，通过共聚焦荧光观察和电镜观察，进一步发现菌株DT-8可以在油菜根部细胞间穿梭和通过根部细胞间隙在组织中蔓延；同时，在下胚轴维管束中可观察到DT-8菌丝随维管束方向蔓延。在叶面上接种菌株DT-8RFP也可以观察到标记的菌丝。这些结果表明，菌株DT-8可以在油菜植株中内生生长。经在MS组织培养瓶中培养6个月后，部分油菜植株开始死亡(8/32和6/23)，同时在其上可以观察到菌丝的生长。挑取菌丝进行培养，发现菌株为核盘菌，分别在8和6个培养物中有3和4个菌落携带病毒。但在健康的植株上及穴盆栽培的植株上均未分离出核盘菌。在经过菌株DT-8处理的油菜上接种核盘菌菌株1980-hyg，14天后自病斑上重新分离获得13株分离物中5株分离物中携带SsHADV-1，且表现出生长速度减弱、致病力降低、菌落形态异常等弱毒相关特性。在田间不同时期喷施菌株DT-8菌丝悬液后，采集和分离的菌株中，有15%携带有DNA病毒。
2.SsHADV-1显著改变核盘菌致病相关基因的表达。为了解析菌株DT-8在感染SsHADV-1的情况下由死体营养型病原真菌转变为内生真菌的机理，通过转录组测序技术，对菌株DT-8在PDA培养基上和接种在油菜叶片上与DT-8VF菌株的基因表达差异进行了分析。对显著差异基因(DEGs)进行KEGG富集和FungiFun功能富集分析，发现两种培养方式的菌株DT-8中上调表达的DEGs均主要富集在DNA的错配修复和重组相关通路中，这些通路相关基因的变化与病毒的复制有关；下调表达的DEGs均集中在代谢相关的通路中。对接种在油菜叶片上的菌株DT-8相比于DT-8VF菌株三个时期(12hpi、18hpi和24hpi)的DEGs进行详细分析，发现细胞壁降解酶类和小分泌蛋白等致病相关基因显著下调表达，同时侵染垫的形成和草酸合成等侵入相关基因正常表达。这表明SsHADV-1对核盘菌的侵染能力没有显著的影响，但削弱了其对寄主植物的危害，可能是菌株DT-8成功入侵到油菜植株中营内生生长的原因。
3.菌株DT-8促进油菜生长并显著提高油菜的抗病力。将表面消毒的油菜种经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后，MS平板上萌发，移植到培养土中培养36d，地上部分鲜重为17.15±2.0g/株，显著高于未处理的对照植株(14.55±1.1g/株)；同时，在无菌组培瓶中MS培养基上培养的油菜植株，也获得了相似的促生结果。表明，菌株DT-8内生生长可以促进油菜植株的生长。在培养土中培养36d的油菜叶片上，活体接种核盘菌1980菌丝块，菌株DT-8处理油菜植株上，病斑直径(1.22±0.08cm)显著低于未接种的对照植株(1.51±0.12cm)；同时，对油菜叶片上活体接种灰葡萄孢菌株B0510，菌株DT-8接种的油菜植株上的病斑(1.54±0.24cm)显著小于未接种的对照植株(1.99±0.10cm)。这表明菌株DT-8内生生长可以促进油菜生长，并且可以提高由此植株对核盘菌和灰葡萄孢的抗性。
4.菌株DT-8改变油菜抗病及生长相关途径基因的表达。为了探究菌株DT-8内生影响油菜生长发育和抗病性的分子机理，取菌株DT-8处理的油菜植株茎尖生长点部位进行转录组分析，发现菌株DT-8对油菜植株基因表达的影响幅度较小，与对照植株相比，显著差异表达的基因总共只有348个，约占已知总基因数(101041)的3.4‰，其中显著上调表达的基因有258个，显著下调表达的基因有90个。上调表达的基因大部分与抗病相关，包括植物病原信号和抗性信号传导相关基因(CDPK、CML、WRKY33和MKK9)、茉莉酸和乙烯合成及其调控的抗性相关基因(AOC、ACS和ERF等)。下调表达的基因主要是以CCA1和LHK为主效基因的节律调节相关基因，该途径节律调节相关基因的下调表达可能与油菜植株生物产量的提高有关。表明油菜植株抗性的提高是可能通过菌株DT-8诱导抗性相关表达实现的，而生物产量的提高可能是通过抑制节律调节相关基因的下调表达实现的。
5.田间喷施菌株DT-8可以显著提高油菜产量。根据菌株DT-8可以在油菜中内生并且可以在油菜表面长期生长的这一特性，将菌株DT-8的菌丝液喷施到油菜植株上进行油菜菌核病的田间防治试验。2013年-2015年，我们在湖北省武汉、鄂州、随州和襄阳等地分别进行DT-8菌丝液防治油菜菌核病的小区试验和大田试验。在小区试验中分别在苗期、抽薹期、盛花期、角果期，采取两种浓度(～1×105cfu/mL和～1×104cfu/mL)的菌丝液进行喷施；大田试验油菜盛花期进行DT-8菌丝液的喷施(～1×104cfu/mL)。连续3年各地在小区试验和大田试验中，DT-8菌丝液处理显著降低油菜菌核病的病情指数防控率高达50%左右，产量提高10%-20%，使油菜籽的含油量显著上升高达3.8%。
6.灰葡萄孢中发现的新型DNA真菌病毒BcHADV-1，与灰葡萄孢的弱毒相关。BcHADV-1具有一个34nm等轴对称的病毒粒子，其基因组有四个1700nt左右的单链环状的DNA组成。这四个基因组分共有有一个300nt的共同区域(common region)、特殊的茎环结构和独特的nonanucleotide序列"TAAAATTTT"。进化分析显示在葡萄孢属真菌进行种间分化之前，BcHADV-1-like病毒便于与葡萄孢属菌株之间存在基因水平转移。BcHADV-1的Rep与FgGMTV1具有一定的亲缘关系，而BcHADV-1的CP基因与其他病毒的CP均没有亲缘关系。因此，BcHADV-1可能代表着与Genomoviridae亲缘关系比较近的新的CRESSDNA病毒。同时，BcHADV-1与灰葡萄孢的弱毒相关。
本研究首次发现核盘菌可以在油菜植株中内生的生物现象，证明菌株DT-8的内生可以促进油菜植株的生长、增强油菜植株的抗病性。田间试验表明，感染低毒相关病毒的病原真菌可以作为植物疫苗保护植物，显著提高植物产量。本研究揭示了感染真菌病毒后，病原真菌的生活方式发生改变的现象，为利用真菌病毒控制作物病害研究提供新思路。同时，菌株DT-8的内生对SsHADV-1传播的促进作用，揭示了SsHADV-1传播的新途径，并为真菌弱毒相关病毒传播方式的探索提供了新的方向。为真菌病毒、病原真菌和寄主植株三者之间相互作用关系的研究提供了研究模型。同时，灰葡萄孢中DNA病毒BcHADV-1的发现预示着这种新型生物防治模式在灰霉病的防治中可能同样适用。Genomoviridae中可能具有丰富的真菌弱毒相关病毒资源，等待人们去开发用于真菌植物病害的生物防治。
1.携带SsHADV-1的核盘菌菌株DT-8可以在油菜上内生性生长，并在核盘菌群体中传播病毒。在油菜抽薹期喷施DT-8的菌丝片段，7周之后，在油菜成熟期的果荚上可以检测到病毒的DNA。为了确认携带核盘菌的菌株可以在油菜内或者表面生长，将菌株DT-8菌丝块接种到油菜叶片上，一周后未产生任何病斑，取距DT-8菌丝块约1cm位置的油菜叶片组织进行共聚焦荧光观察，发现菌株DT-8可以在油菜叶片表面蔓延生长，同时形成简易侵染垫的结构侵入油菜组织中吸取营养物质。表面消毒的油菜种子经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后，于MS平板上萌发，之后分别移至含有MS培养基的组织培养瓶和无菌培养土中，培养20d和30d。PCR检测证实在油菜的根、下胚轴和叶等部位均可检测到SsHADV-1的DNA和核盘菌的DNA，表明菌株DT-8可以在油菜上生长。利用菌株DT-8RFP(mCherry荧光蛋白标记的菌株DT-8)处理油菜，通过共聚焦荧光观察和电镜观察，进一步发现菌株DT-8可以在油菜根部细胞间穿梭和通过根部细胞间隙在组织中蔓延；同时，在下胚轴维管束中可观察到DT-8菌丝随维管束方向蔓延。在叶面上接种菌株DT-8RFP也可以观察到标记的菌丝。这些结果表明，菌株DT-8可以在油菜植株中内生生长。经在MS组织培养瓶中培养6个月后，部分油菜植株开始死亡(8/32和6/23)，同时在其上可以观察到菌丝的生长。挑取菌丝进行培养，发现菌株为核盘菌，分别在8和6个培养物中有3和4个菌落携带病毒。但在健康的植株上及穴盆栽培的植株上均未分离出核盘菌。在经过菌株DT-8处理的油菜上接种核盘菌菌株1980-hyg，14天后自病斑上重新分离获得13株分离物中5株分离物中携带SsHADV-1，且表现出生长速度减弱、致病力降低、菌落形态异常等弱毒相关特性。在田间不同时期喷施菌株DT-8菌丝悬液后，采集和分离的菌株中，有15%携带有DNA病毒。
2.SsHADV-1显著改变核盘菌致病相关基因的表达。为了解析菌株DT-8在感染SsHADV-1的情况下由死体营养型病原真菌转变为内生真菌的机理，通过转录组测序技术，对菌株DT-8在PDA培养基上和接种在油菜叶片上与DT-8VF菌株的基因表达差异进行了分析。对显著差异基因(DEGs)进行KEGG富集和FungiFun功能富集分析，发现两种培养方式的菌株DT-8中上调表达的DEGs均主要富集在DNA的错配修复和重组相关通路中，这些通路相关基因的变化与病毒的复制有关；下调表达的DEGs均集中在代谢相关的通路中。对接种在油菜叶片上的菌株DT-8相比于DT-8VF菌株三个时期(12hpi、18hpi和24hpi)的DEGs进行详细分析，发现细胞壁降解酶类和小分泌蛋白等致病相关基因显著下调表达，同时侵染垫的形成和草酸合成等侵入相关基因正常表达。这表明SsHADV-1对核盘菌的侵染能力没有显著的影响，但削弱了其对寄主植物的危害，可能是菌株DT-8成功入侵到油菜植株中营内生生长的原因。
3.菌株DT-8促进油菜生长并显著提高油菜的抗病力。将表面消毒的油菜种经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后，MS平板上萌发，移植到培养土中培养36d，地上部分鲜重为17.15±2.0g/株，显著高于未处理的对照植株(14.55±1.1g/株)；同时，在无菌组培瓶中MS培养基上培养的油菜植株，也获得了相似的促生结果。表明，菌株DT-8内生生长可以促进油菜植株的生长。在培养土中培养36d的油菜叶片上，活体接种核盘菌1980菌丝块，菌株DT-8处理油菜植株上，病斑直径(1.22±0.08cm)显著低于未接种的对照植株(1.51±0.12cm)；同时，对油菜叶片上活体接种灰葡萄孢菌株B0510，菌株DT-8接种的油菜植株上的病斑(1.54±0.24cm)显著小于未接种的对照植株(1.99±0.10cm)。这表明菌株DT-8内生生长可以促进油菜生长，并且可以提高由此植株对核盘菌和灰葡萄孢的抗性。
4.菌株DT-8改变油菜抗病及生长相关途径基因的表达。为了探究菌株DT-8内生影响油菜生长发育和抗病性的分子机理，取菌株DT-8处理的油菜植株茎尖生长点部位进行转录组分析，发现菌株DT-8对油菜植株基因表达的影响幅度较小，与对照植株相比，显著差异表达的基因总共只有348个，约占已知总基因数(101041)的3.4‰，其中显著上调表达的基因有258个，显著下调表达的基因有90个。上调表达的基因大部分与抗病相关，包括植物病原信号和抗性信号传导相关基因(CDPK、CML、WRKY33和MKK9)、茉莉酸和乙烯合成及其调控的抗性相关基因(AOC、ACS和ERF等)。下调表达的基因主要是以CCA1和LHK为主效基因的节律调节相关基因，该途径节律调节相关基因的下调表达可能与油菜植株生物产量的提高有关。表明油菜植株抗性的提高是可能通过菌株DT-8诱导抗性相关表达实现的，而生物产量的提高可能是通过抑制节律调节相关基因的下调表达实现的。
5.田间喷施菌株DT-8可以显著提高油菜产量。根据菌株DT-8可以在油菜中内生并且可以在油菜表面长期生长的这一特性，将菌株DT-8的菌丝液喷施到油菜植株上进行油菜菌核病的田间防治试验。2013年-2015年，我们在湖北省武汉、鄂州、随州和襄阳等地分别进行DT-8菌丝液防治油菜菌核病的小区试验和大田试验。在小区试验中分别在苗期、抽薹期、盛花期、角果期，采取两种浓度(～1×105cfu/mL和～1×104cfu/mL)的菌丝液进行喷施；大田试验油菜盛花期进行DT-8菌丝液的喷施(～1×104cfu/mL)。连续3年各地在小区试验和大田试验中，DT-8菌丝液处理显著降低油菜菌核病的病情指数防控率高达50%左右，产量提高10%-20%，使油菜籽的含油量显著上升高达3.8%。
6.灰葡萄孢中发现的新型DNA真菌病毒BcHADV-1，与灰葡萄孢的弱毒相关。BcHADV-1具有一个34nm等轴对称的病毒粒子，其基因组有四个1700nt左右的单链环状的DNA组成。这四个基因组分共有有一个300nt的共同区域(common region)、特殊的茎环结构和独特的nonanucleotide序列"TAAAATTTT"。进化分析显示在葡萄孢属真菌进行种间分化之前，BcHADV-1-like病毒便于与葡萄孢属菌株之间存在基因水平转移。BcHADV-1的Rep与FgGMTV1具有一定的亲缘关系，而BcHADV-1的CP基因与其他病毒的CP均没有亲缘关系。因此，BcHADV-1可能代表着与Genomoviridae亲缘关系比较近的新的CRESSDNA病毒。同时，BcHADV-1与灰葡萄孢的弱毒相关。
本研究首次发现核盘菌可以在油菜植株中内生的生物现象，证明菌株DT-8的内生可以促进油菜植株的生长、增强油菜植株的抗病性。田间试验表明，感染低毒相关病毒的病原真菌可以作为植物疫苗保护植物，显著提高植物产量。本研究揭示了感染真菌病毒后，病原真菌的生活方式发生改变的现象，为利用真菌病毒控制作物病害研究提供新思路。同时，菌株DT-8的内生对SsHADV-1传播的促进作用，揭示了SsHADV-1传播的新途径，并为真菌弱毒相关病毒传播方式的探索提供了新的方向。为真菌病毒、病原真菌和寄主植株三者之间相互作用关系的研究提供了研究模型。同时，灰葡萄孢中DNA病毒BcHADV-1的发现预示着这种新型生物防治模式在灰霉病的防治中可能同样适用。Genomoviridae中可能具有丰富的真菌弱毒相关病毒资源，等待人们去开发用于真菌植物病害的生物防治。