线粒体是细胞内的重要细胞器之一,它不仅为生命体的新陈代谢提供能量,还参与调控多项生理进程,诸如细胞凋亡与衰老过程。此外,线粒体的动态变化和异质性也与疾病的发生和发展密不可分,具有极其重要的研究价值。随着科技的不断进步,线粒体的原位分析与检测技术已经十分成熟。但是目前活体测定方法不能对细胞内所有线粒体进行大规模分析,检测数量也具有局限性。对线粒体进行分离与纯化,结合多组学技术可以开展深入研究。目前,传统的线粒体分离手段还达不到理想的纯度,抑或是无法完成大批量的制备需求,因此发展新的分离分析技术显得尤为重要。自由流电泳(Free-Flow Electrophoresis,FFE)是一类兼具制备与分析功能的分离技术。它具备了分离条件温和、分离模式多样、全液相和持续分离等优点。对于线粒体这类具有生物活性但又相对脆弱的生物大颗粒,FFE是十分理想的分离方法。近年来,国外关于FFE分离线粒体的文献报道较多,但绝大多数都是采用自由流区带电泳(Free-Flow Zone Electrophoresis,FFZE)模式进行分离。虽然FFZE模式操作简便,条件温和,但可能造成线粒体的回收率低、富集不充分等问题,并且在线粒体亚群的区分上分辨率有限。同时,FFZE无法估测待分离样品的等电点,对于高度异质的线粒体样品来说,缺少了一个可用于表征的数值参考。在本课题中,我们首先利用传统FFZE进行线粒体分离的条件摸索,并用于自主研发的循环式自由流等电聚焦(Recycling Free-Flow Isoelectric Focusing,RFFIEF)。同时,考虑到线粒体容易受到外界环境的影响,我们对RFFIEF的进样方式做了改进,首次提出将传统的混合进样方法改变为单管进样。这一改进不仅极大缩短了线粒体接触化学试剂的时间,并且将不同状态下的线粒体亚群成功分开,制备了更多完整的线粒体组分。在实验中,不同的线粒体亚群根据其等电点的差异被富集到6个收集管。透射电镜的结果显示,从偏酸性组分(pH 4.70)到近中性组分(pH 6.61),线粒体的形态结构逐渐变好,完整度也明显增加。我们对RFFIEF回收之后的线粒体亚群组分进行了膜电位测定。结果表明,等电点高的线粒体亚群,其膜电位也相对较高,这说明我们实验方法不仅具备细胞器亚型的分离能力,还能维持其生物学活性,体现了RFFIEF制备性这一优点。此外,我们对纯化的线粒体组分进行了蛋白组学分析,结果表明,等电点高的线粒体组分(pH 6.62-6.80)比等电点低的组分(pH 4.44-4.64)多鉴定到26%的蛋白。并且,相比用传统差速离心方法的到的线粒体粗品,RFFIEF制备的完整线粒体组分也将蛋白的总鉴定数提高了21%。本论文工作的意义在于:(1)改进了循环式自由流等电聚焦的进样方式,使其能够最大限度地发挥它在生物样品分离与制备方面的优势;(2)获得了更多完整的线粒体组分,具备高回收率(85%以上)的同时,实现了线粒体亚群间的分离与富集;(3)拓展了RFFIEF的应用范围,不仅能实现复杂、异质的样品分离,还能用于未知样品的等电点范围估测,为相关研究提供了有益的参考。